您现在所在的位置:主页 > 技术支持 > 常见问题与解答
     常见问题与解答
引物合成常见问题分析及对策
文章来源:genecteate 作者:genecteate 发布时间:2017-05-11 11:34
     1、 如何溶解引物?

答:干燥后的引物质地非常疏松,开盖前需先离心,将引物粉末收集到管底。根据说明书上的公式计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。

溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。

2、 如何保存引物?

答:引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成片状物质。溶解前的引物在室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高,合成的OD数较大,建议分装,避免反复冻融。修饰荧光引物需避光保存。

3测序发现引物有突变是怎么回事?

答:测序发现引物区域有突变,特别是40个碱基以下的引物,发生的概率很小,但是也会存在。您所提交引物序列一般是通过电脑直接COPY到合成仪的,我们也有一套控制办法,预防碱基输入错误,基本不存在人工输错的现象。

引物合成是一种多步骤的化学反应,合成效率最高为99%,副产品不可以避免。在合成过程中,造成碱基插入,缺失,置换突变的因素客观存在。引物序列中插入突变往往是碱基重复,一般认为,偶连过程中,正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去,故发生插入同一碱基的突变。缺失突变,一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的,Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物,在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变,产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护,即引物上可能含有残留保护基团,引物的这些区域不能很好地与互补链配对,当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中,可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体 (脱嘌呤),2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A,测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解,测序就会发现碱基GA的缺失。

目前引物突变的问题并没有办法彻底解决,一些降低突变发生的频率建议和措施还停留在实验室阶段,不能应用于规模化生产。引物合成的固相合成原理都一样,采 用的机器也基本相同,合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的,所有合成服务商都会遇到类似问题,没有人可以超脱。

4如果测序发现突变,该如何处理?

答:遇到这种情况,您应当首先和我们取得联系,我们的生产人员会检查生产的原始记录,核对合成序列是否和定单一致。如果确认引物合成序列没有输错,我们建议重新挑取克隆测序。根据我们经验,40个碱基以下的引物,测1-2个克隆就可以了;40个 以上的特别是用于全片段拼接合成的,需要多测一些。一般情况下,每个克隆突变的位点都不一样,提示正确的总是有的,就是如何找到它。您也可以要求我们将引 物免费重合一次,不过重合的引物和第一次的引物一样,都可能含突变,不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中,如果发现一段区域突变 点不多,就多测几个,否则就重合一下引物。

5引物不纯会有什么后果?

答:引物不纯可能会导致:1)非特异性扩增;2)无法用预先设计在引物5'端酶切位点的酶切开,特别是没有保护碱基的引物;3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

6、拿到引物后,想在实验室检测纯度,如何实现?

答:实验室可通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行引物纯度的检测:

使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,碱基数≤12个的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,>60个碱基的引物用12%