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ChIP检测常见问题与解答

  • Q:ChIP技术的原理及应用?

    染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是将样品中同抗体靶蛋白相互作用的DNA随免疫复合物沉淀,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。

  • Q:ChIP-Seq和ChIP-qPCR有何异同?

    染色质免疫共沉淀(ChIP)所获得的DNA产物,在ChIP-Seq中通过高通量测序的方法,在全基因组范围内寻找目的蛋白(转录因子、修饰组蛋白)的DNA结合位点片段信息;ChIP-qPCR需要预设待测的目的序列,针对目的序列设计引物,以验证该序列是否同实验蛋白结合互作。

  • Q:ChIP实验需要准备多少样品?

    每一份独立样品的最低需要量,动物细胞>2x107,动物组织>1g,植物组织>4g。请尽量提供更多样品,便于金开瑞进行预实验、提高成功率。

    细胞可以提供培养瓶或冻存细胞,由金开瑞进行培养(或复苏),也可以收取细胞后速冻、-80保存至寄送。注意:能够由金开瑞进行培养及处理的细胞,尽量交由金开瑞进行培养(培养需收费);在交联之前未经冻存的样品对于ChIP效率很有好处。

    动植物组织样品需在离体后尽快液氮速冻、-80保存至寄送。植物组织尽量选取幼嫩新鲜部分。

    样品寄送须使用足量干冰。

  • Q:ChIP-Seq中的测序DNA样本需要多少产量?

    通常是≥10ng。随着目前建库技术的不断完善,低至5ng的DNA量也能被建库成功;少数测序公司为了降低自身风险提出20ng的要求,通过可以协商降低该送样要求。尤其是一些转录因子,最终能够捕获的DNA量会很低。

  • Q:ChIP关于抗体有何要求?如何选择?

    ChIP实验中的抗体对于特异性、亲和力、效价都具有较高要求,能够成功用于WB、IHC等实验的抗体并不确保能成功运用于ChIP,因此需要选用经过ChIP验证的商品化抗体,这类抗体常会标明ChIP grade。

    关于单抗和多抗。单抗具有特异性优势,但风险在于其识别表位可能恰好被掩蔽(DNA或交联环节),而多抗可识别多个表位可基本避免该风险。因此单多抗各有优缺点,应重点关注该抗体是否经过ChIP验证。

  • Q:所研究的蛋白难以找到ChIP级抗体怎么办?

    较常用的方式可以将目的蛋白同某种标签融合表达,比如HA、GFP、Myc等标签,使用这些标签抗体的ChIP级抗体,这种途径也常见于发表文献中。

  • Q:染色质片段大小在哪个范围比较合适?

    对于ChIP-seq,片段在200-500 bp左右是最合适范围;对于ChIP-qPCR,片段在200-800 bp左右适宜。

  • Q:植物样本处理和动物组织/细胞有何区别?

    植物组织由于细胞壁、气腔等结构的存在,会给交联缓冲液的作用带来困难,因此相对于动物组织/细胞来说,往往需要在抽真空条件下进行交联,而该步骤是一个需要经验及优化的过程。

  • Q:ChIP实验如何设置对照及重复?

    通常ChIP过程产生3份DNA产物,Input、IgG产物、IP产物。Input是染色质片段化后提取获得的总DNA、未经抗体加入免疫沉淀过程,IgG组这是用实验抗体的同型阴性对照抗体、作为mock IP,IP产物即是以实验抗体获得的免疫沉淀产物。

    在后续的qPCR检测中,通常将IgG产物组作为IP产物组的对照。如需设置阳性对照抗体,可以选择Histone H3或者RNA polymerase II,然后以GAPDH或Actin等作为检测基因。

    在后续的Sequence中,通常将Input组产物作为测序对照样品。

  • Q:ChIP实验风险如何判断?

    ChIP实验以标签来判断实验风险,重组标签的转录因子>内源转录因子>组蛋白;当以重组蛋白作为靶蛋白时,重组蛋白同内源蛋白可能存在结合活性、结合位点差异;以标签抗体进行ChIP时、染色质结合位点本身会被内源蛋白竞争,这些都会影响到ChIP过程的特异性捕获效率。