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DNA测序常见问题与解答

  • Q:金开瑞所接收的测序样品有哪些? 具体要求是怎样的?

    所接收的测序样品包括大肠杆菌菌样、质粒、PCR产物:

    菌液样品需要过夜培养(12h)摇混,体积在0.5~1ml左右;质粒样品要求浓度大于50ng/μl,体积大于20μl;PCR未纯化样品要求浓度大于50ng/μl,体积大于50μl;PCR已纯化样品要求浓度大于30ng/μl,体积大于20μl。

    详情可参考http://www.genecreate.cn/DNA_sequencing/页面送样要求。

  • Q:提供DNA测序样品时,提供何种形态的比较好?

    推荐您提供菌体,由金开瑞来提取质粒,这样DNA样品比较稳定。如果您可以提供DNA样品,我们也很欢迎,但一定要注意样品纯度和数量。如果提供的DNA量不够,我们就需要对质粒进行转化,此时需收取转化费。

    提供的测序样品为PCR产物时,特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物必须进行切胶回收,否则无法得到良好的测序效果。

  • Q:提供的测序样品为菌体时,以什么形态提供为好?

    一般,菌体的形态有:平板培养菌、穿刺培养菌,甘油保存菌或新鲜菌液等。如需寄送,金开瑞推荐提供穿刺培养菌或新鲜菌液。

    平板培养菌运送特别不方便,我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎,面目全非,需要用户重新寄样。这样既误时间,又浪费客户的样品。一旦是客户非常重要的样品时,其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。

    制作穿刺菌时,可在1.5 ml的Tube管中加入琼脂培养基,把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中,37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月,并且不容易污染,便于运送。

  • Q:提供的测序样品为菌液时,为什么需要提供新鲜的菌液?应如何提供新鲜的菌液?

    首先,新鲜的菌液易于培养,可以获得更多的DNA,同时最大限度地保证菌种的纯度。如果您提供新鲜菌液,用封口膜封口以免泄露;也可以将培养好的4~5ml菌液沉淀下来,倒去上清液以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。

  • Q:DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?

    溶解DNA测序样品时,用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应,需要一个最佳的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后,在进行测序反应时,DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件,造成Taq酶的聚合性能下降。

  • Q:对于自带的测序引物有什么要求?

    如果您是自带引物,请注明浓度,最好调整到5pmol/μl (即5μM),体积应大于20μl; 上下游引物需分开存放,并标注清楚,另外需注意:

    特异性与测序模板结合,不能有多于4个碱基以上的错配现象;

    不能含有混合碱基;

    长度17~25碱基;

    纯度高,最好PAGE纯化;

    用ddH2O溶解,不要用TE缓冲液溶解。

  • Q:应怎样选择(设计)测序用引物?

    测序用引物要求非常严格,不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板结合,3' 端的几个碱基能完全配对,即使引物长达80~100多个碱基,只要调整PCR反应条件,也能成功进行PCR反应。

    而测序用引物必须严格符合以下要求。金开瑞的测序用引物全用引物设计软件Oligo设计。在金开瑞测序时,我们可免费帮助设计测序用引物。

    • 长度在15~25个碱基左右,一般选择20个碱基(根据GC含量作适当调整),3' 端尽量选择G或C碱基(但不绝对),以增加与模板的结合能力。
    • Tm温度应选择50℃~70℃左右。
    • GC含量应选择在50%左右,尽量避开A、T、G、C的连续结构。
    • 避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。
    • 保证引物和模板100%匹配,特别是3'端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点。
  • Q:测序完成后所交付的内容包括什么?

    测序结果,包括1份ab1格式的图谱文件和1份seq格式的序列文件。

  • Q:测序完成后,测序样品和引物将如何处理?

    如果您需要返还测序样品或引物(您所提供的),我们在发送测序报告的同时,会按要求寄回样品或引物(您所提供的)。

    对于未返还的测序样品和引物,公司负责保存二个月(从样品收到之日算起),超过二个月还需测序的样品,请您另行提供。

  • Q:PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别?

    众所周知,PCR扩增过程中会出现很多错配现象,但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时,其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象,但大多数分子(或许是几十万个分子)在这个点上应该还是正确的,在测序时,错配现象也就反映不出来了。因此,PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中,很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此,PCR片段经克隆后的测序结果,往往存在着一些错配的序列,和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象,在PCR反应时,请选用保真性能高的DNA聚合酶。

  • Q:为什么在测序报告上找不到引物序列?

    这里分四种情况:

    1、目前使用的测序方法是在ddNTP上做荧光标记,测序仪通过检测ddNTP上的荧光来读取序列,因为引物本身是不做荧光标记的,所测序列是从引物3' 末端后第一个碱基开始的,所以在测序结果上找不到测序引物的序列。如果是PCR产物,要想得到PCR引物的序列,可以将PCR产物进行双链测通或者将PCR产物克隆到载体上,用载体上的引物测序;

    2、找不到克隆片段的扩增引物。原因可能是您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近,由于荧光染料的干扰在序列开始的部分不会十分准确;

    3、还有一种可能是您的插入片段的插入方向是反的,这时您不妨找一下您引物的互补序列;

    4、存在单引物扩增,有一条引物的特异性不好,有多个结合位点导致只有一条引物参与扩增。

  • Q:测序结果有很多套峰,还照常收费,为什么? 出现套峰的原因是什么?

    DNA模板上出现二处以上的引物结合位点,或者DNA模板上有严重的重复序列,以及测序引物不纯时, 测序结果便会出现套峰现象。出现这种现象的原因由DNA模板本身或者引物本身所造成,对这些结果(公司保证进行2次以上的测序工作),公司会根据具体情况进行收费。

    在测序反应中,模板或引物的原因都可能造成套峰的形成,归结其形成原因有以下几点:

    1、测序引物在模板上有两个结合位点形成套峰;

    2、模板不纯,如果是质粒或是菌液,原因是非单克隆,如果是PCR,原因为非特异性条带;

    3、模板序列的特殊结构,如poly结构、发卡结构等;

    4、引物降解,引物不纯,或引物的特异性不好。

  • Q:测序结果不到800 Bases,还照常收费,为什么?

    如在DNA样品中的DNA序列分布匀称,没有复杂结构时,正常的测序反应能保证达到800 Bases以上。但有一些DNA样品立体结构复杂,造成聚合酶延伸反应终止,测序信号突然减弱或消失,或者测序结果出现套峰现象。出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成(公司保证进行2次以上的测序工作)。对这些结果,公司会根据具体测序情况,进行收费。

  • Q:我的样品上有一个杂合位点,为什么在你们的报告上看不到杂合的信号?

    在检查报告时,设备和我们的技术员都倾向于提供给客户一个单一的信号,所以在出现杂合的位置上给出的信号往往是比较强的一个信号。所以如果您的PCR样品上是存在杂合位点的,请在测序订单上注明,我们在修改报告时会加以注意。但如果在您预期出现杂合信号的位置上只有单一的信号,那么我们是不会人为将其修改为杂合位点的。出现这样的情况可能是在您的样品中杂合成份太少的信号强度不足以被检查到,也许有其他更加灵敏的检测手段可以满足您的要求。

  • Q:测序得到的基因序列与标准序列存在差异?

    一段基因序列经扩增后,克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先,在PCR扩增过程中就可能产生错误,将片段克隆到载体中也有可能发生突变;其次,由于仪器准确率的限制,在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下,通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到您的最准确的序列,进行双向测序是很有必要的。只进行简单的单向测序,我们无法保证所测序列的完全准确性,这是由仪器的精度决定的。

  • Q:测序结果和文献资料不一样,为什么?

    原因有很多,如同一种动物,在不同的种族之间,或者不同的个体之间,基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序, 那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果,不能保证和文献序列完全一致,请理解。