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IP-COIP检测常见问题与解答

  • Q:IP、coIP的应用?

    免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)是利用抗原抗体特异性反应纯化富集样品中目的蛋白的一种方法。通常使目标蛋白同抗体-protein A/G形成免疫复合物沉淀而得以收集,然后通过WB检测目的蛋白。

    免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)是将样品中同抗体靶蛋白相互作用的蛋白一同随免疫复合物沉淀,可以检测两种目标蛋白质是否在体内存在相互作用,也可以确定一种蛋白在体内的相互作用蛋白。

  • Q:IP、coIP、pull-down的区别?

    P是利用特异性抗体将样品中的靶蛋白沉淀(收集)下来;coIP是在IP实验过程中保持靶蛋白同其互作蛋白的结合状态,使靶蛋白的互作蛋白共同被沉淀收集;pull-down一般指将靶蛋白通过GST等标签挂于凝胶/磁珠,然后将与靶蛋白存在互作的蛋白收取。

    通常IP或coIP使用组织细胞材料,靶蛋白为内源天然蛋白或组织细胞中过表达蛋白(可融合标签)。Pull-down中的诱饵蛋白一般经重组表达获得。IP和coIP需要使用亲和力好的一抗,选购时需注意相应验证数据。

    简单来说,IP捕获目的蛋白,coIP捕获目的蛋白和其互作蛋白,pull-down用融合标签的重组蛋白来捕获其互作蛋白。

  • Q:coIP需要准备多少样本量?

    coIP实验需要保证足够的蛋白浓度才能维持原本存在的蛋白互作状态,尤其当蛋白丰度较低、相互作用力不强、使用不易提蛋白组织等情况时。而且coIP的实验条件往往需要反复摸索。因此用于coIP实验需准备细胞>2x107,动物组织>500mg,植物组织>2g,并且须更加注意采集后速冻-80℃保存和避免反复冻融。

  • Q:coIP实验成败的主要因素?

    a.所使用的抗体不仅需要优秀的亲和力、特异性,其识别表位还可能被互作蛋白所掩蔽(主要是使用单抗时);

    b.当蛋白互作须发生在特定生理代谢条件、组织细胞类型之中时,coIP实验可能无法获得互作结果;

    c.如果诱饵蛋白和或捕获蛋白在样本中丰度很低时;

    d.两个互作蛋白的亲和力较弱;

    e.当该蛋白互作需要较特定的离子强度,或者需要如Ca离子/Mg离子/ATP等辅因子时,要创造合适的反应条件会变得困难;

    f.一些样品处理提取存在难度,提取足量目的蛋白与保持蛋白天然状态,需通过实验条件达到优化平衡;

    g.外源表达的标签蛋白存在同内源蛋白的位点竞争,这主要在使用标签抗体进行实验时可能存在。

  • Q:IP后WB鉴定到目的蛋白,质谱未鉴定到,为什么?

    IP后WB检测到目的蛋白条带,说明IP过程成功。金开瑞会从自身技术流程步骤做排查,确保相关质控均合格,通过标准品检测质谱当时的状态正常,保证技术流程及质谱性能均无问题。

    如果确实质谱未发现目的蛋白,通常是由于蛋白本身在样品中相对丰度较低导致,由于质谱过程中其他相对高丰度的蛋白可能掩盖部分信号、导致样品中低丰度蛋白未被鉴定。

  • Q:IgG组及IP组均检测到目的条带,为什么?

    coIP-WB鉴定结果IgG组无目的蛋白条带、IP组有目的蛋白条带,说明IP过程成功,此时质谱极低概率会在IgG组中鉴定到目的条带,如果遇到这种情况可能是在切胶及质谱样品处理过程中发生了串染,对IP组中互作蛋白的结论没有影响,IgG组中的蛋白在文章中通常都不是考察对象。

  • Q:CoIP实验成功的评判标准是什么?

    在coIP-WB鉴定结果中,IgG组无目的蛋白条带、IP组有目的蛋白条带,说明IP过程成功;银染胶图中,IP组相对于IgG组有更多蛋白条带、且存在差异,说明coIP过程捕获到互作蛋白;IP产物在质谱检测中鉴定到的蛋白数量不能作为判断实验成败的标准,因为这取决于目的蛋白本身所具有的互作蛋白数量、结合力强弱等方面;IP产物的质谱鉴定数量越多并不代表结果越好。

  • Q:coIP下游还可以开展哪些分析实验?

    coIP所获取的样品,可以借助特异性抗体进行WB验证某种特定蛋白的存在(即认为互作蛋白),也可进行蛋白质谱鉴定找出互作蛋白,尤其当寻找未知互作蛋白时更需通过质谱分析。

    直接用细胞组织内源蛋白进行实验发现的互作蛋白可能是通过其他蛋白形成复合物,当pull-down体系中仅有两个重组蛋白、仍然能存在互作时,说明这两个蛋白是直接互作而不是通过其他蛋白形成多聚复合物。

    将蛋白进行分段阶段表达之后进行pull-down,可以分析发生互作的结构域;将蛋白进行突变后表达,可以分析互作发生的关键氨基酸位点。