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RNA pull down常见问题与解答

  • Q:RNA pull down的实验原理是什么?为什么要做RNA pull down?

    RNA pull down使用体外转录法标记生物素RNA探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

    蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心,如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。若待检测目的蛋白明确,选择Western blot鉴定;若不明确,则可选择质谱鉴定。

    金开瑞现提供RNA pull down检测技术服务, 使用特异性二抗进行检测,能有效避免抗体重链对结果的信号干扰。并且金开瑞配套有世界上最先进的质谱仪,能显著提升检测效果。

  • Q:除了RNA pull down外,金开瑞还可提供哪些lncRNA研究的服务?

    RNA pull down实验与LncRNA的研究是分不开的,为lncRNA生物学功能的验证起到了至关重要的作用。除此之外,金开瑞可提供的lncRNA研究服务包括: lncRNA在不同组织中表达水平的检测、lncRNA特点探究、lncRNA的功能研究、lncRNA结合蛋白质的检测、miRNA在lncRNA的作用靶点预测及功能验证、lncRNA表达调控的研究。

    详情可参考长链非编码RNA(lncRNA)研究

    更多非编码RNA研究方面可参考非编码RNA研究方案

  • Q:RNA pull down实验前富集LncRNA都有哪些方法?

    LncRNA的富集大致上有三种方法:

    1) 探针法:针对该LncRNA的序列,设计生物素标记的探针。此种方法最关键的是探针的特异性,所以最好用Northern Blot检测探针的特异性。 可以结合内源的LncRNA是探针法的最大优势。缺点就是比较贵,需要的样品量大。

    2) 生物素标记法:在LncRNA的5‘端加上T7启动子,利用体外转录试剂盒,可以制备大量的LncRNA。再通过生物素标记试剂盒,就能得到大量的生物素标记的LncRNA。常用的折叠的方法退火,从95℃退火到4℃,大约30秒一度就可以了。

    3) TRSA法:除了生物素,链霉亲和素还可以识别TRSA结构,因此在LncRNA的一端加上TRSA序列也是不错的选择。

  • Q:RNA pull-down是否可以做circRNA?

    可以,前提是circRNA在细胞中表达丰度要高。

  • Q:RNA pull down的实验有对照吗?

    有,探针法和生物素标记法的对照都是相应的反义序列:探针的反义序列以及长非编码RNA的反义序列。TRSA法的对照是TRSA序列本身。

  • Q:RNA pull down的实验如何防止RNA降解?

    RNA pull down实验的一大难点就是RNA本身易降解,所以过程中要禁止RNase,以防止降解。因此在整个实验过程中除了EP管、枪头、镊子这些常用的器具需要灭菌,所有试剂均需要DEPC•H2O配置并灭菌!处理后的耗材需要尽快用掉,超过两周则需要重新处理。操作台需要用RNaseZAP擦净,以去除环境中的RNA酶的影响。

  • Q:RNA pull down后银染,条带背景深是什么原因?

    背景深需考虑是不是SDS-PAGE染色时间过长或者抗体的质量问题,多克隆抗体经常会出现这种情况,最有可能的情况是样品中包含的非特异性蛋白太多了,针对这一点,有以下解决措施:

    1) 优化孵育时间、温度、盐浓度等条件;

    2) 优化缓冲体系,使用严谨性高的缓冲体系;

    3) 提高裂解液的质量。

  • Q:RNA Pull-down拉下蛋白PAGE电泳银染条带颜色浅且模糊是什么原因?

    可能的原因有以下几点:

    1) 选取的组织或细胞样品其中互作蛋白表达量很低;

    2) 体外转录得到的RNA降解或者不是全长;

    3) Pull-down实验孵育时间不长。

  • Q:RNA Pull-down拉下蛋白银染后看不到互作蛋白是什么原因?

    可能的原因有以下几点:

    1) 选取的RNA序列不对;

    2) 样品中没有表达互作的蛋白质;

    3) 互作蛋白浓度低,银染图肉眼观察不到差异条带。

  • Q:RNA结合蛋白没有结合的可能原因和解决方案?

    RNA结合蛋白没有结合,可能是因为靶蛋白量不足或者RNA探针和蛋白的亲和力本来就低,也可能缓冲体系不对。

    解决办法包括有:

    1) 增加上样蛋白量;

    2) 应用低盐体系;

    3) 加入交联试剂。

  • Q:RNA结合蛋白的亲和力不够的可能原因和解决方案?

    可能原因:结合缓冲环境没有优化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探针用量不足等。

    解决办法:可优化孵育时间、温度、盐浓度等条件、增加裂解液和蛋白上样量的比例、适当改变磁珠及探针用量、增加裂解液、确定生物素和链霉亲和素效率等。

  • Q:RNA结合蛋白结合的非特异性高的可能原因和解决方案?

    可能原因:

    1)缓冲环境没有优化;

    2)缓冲环境严谨性低;

    3)样品没有裂解完全和裂解体系没有优化。

    解决方法:

    1)优化孵育时间温度盐浓度等条件;

    2)使用严谨性高的缓冲体系;

    3)调低RNA探针和样品的比例;

    4)提高裂解液的量。