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WB检测常见问题与解答

  • Q:WB的实验原理和应用?

    WB(Western blot),即蛋白印迹或免疫印迹(immunoblotting),是一项在分子生物学、生物化学、免疫学等领域中应用非常广泛的技术。这一技术利用抗体与组织或细胞样品中特定蛋白的特异性结合作用,根据显色条带的位置和强弱实现蛋白鉴定和表达分析。

    WB技术具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性。选用合适的内参抗体能够校正蛋白定量和上样过程中的误差,通过灰度计量可以定性或定量分析不同样品中蛋白表达情况。

    金开瑞提供WB检测技术服务,提供编码基因表达水平的确凿证据,用于特定基因调节、基因功能研究,也可以作为蛋白芯片、蛋白质谱的验证实验。

  • Q:WB对于提供的样本有什么要求?

    请提供的细胞数量保证5x106或更多,动物组织至少200mg以上,植物组织1g以上,须在取材后(最好经液氮速冻)保存于-80℃,干冰运输。取材时需尽量避免较多血液、泥土等干扰保留在材料表面,可用生理盐水等迅速清洗后速冻。

    检测抗体数量增多时样本质量须随之增加,珍贵样本在项目完成后剩余的可以寄还给您。

  • Q:WB实验中一抗使用量需要多少?

    根据不同抗体的效价、浓度、亲和力等因素不同,多数商品化抗体稀释比例在1:200-1:2000左右,可参看抗体说明书进行预实验后调整。请您尽量提供足量的抗体(也可以选择由金开瑞提供一抗),项目完成后金开瑞可以寄返剩余抗体。

  • Q:WB实验中的抗体可以通用于IHC等其他实验吗?

    WB过程中目的蛋白被变性,抗体识别目的蛋白的线性表位,绝大多数能应用于IHC、IP、FACS等实验的抗体都能够用于WB实验,但反之并不一定能适用。

  • Q:为什么有时目的条带大小同理论预期分子量有偏差?

    当条带所示的实际大小同理论有偏差时,可能由以下一些原因导致:蛋白发生如磷酸化、糖基化等翻译后修饰时条带会上移,蛋白发生剪切(如前体)时条带会下移,蛋白存在不同的可变剪切体或亚型,强相互作用大分子存在时变性不彻底。

    此外,WB实验中使用的预染蛋白marker由于携带染料程度不稳定的原因,也可能导致表观分子量与理论预期出现偏差。

  • Q:为什么主带之外有时会出现杂带?

    导致杂带出现的可能原因包括:抗体特异性不足,目的蛋白存在不同修饰状态或有剪切降解形式,一抗或二抗使用过量,蛋白上样量过大,曝光时间过长,膜漂洗不充分,等原因。

    金开瑞会通过条件优化尽量减少杂带出现,但当抗体或样品特性造成少量杂带存在时,只要不影响主目的条带判别并不影响数据图片的应用。

  • Q:为什么有时胶片会出现明显较深的背景?

    在通过条件优化排除诸如封闭不充分、样品中存在杂质、抗体过量、漂洗不充分等实验原因之外,当特异性识别的目的条带信号太弱时,为了显示出目的条带而不得不延长曝光时间,随之使得背景变脏,此时关键点在于整个反应的“性噪比”太低,最好换用特异性、亲和力更佳的一抗。

  • Q:为什么有时候条带会出现拖带或者弯曲?

    在使用特定裂解缓冲液时,或者一些植物或脂肪含量高的样品中成分较复杂,会对电泳条带产生干扰;样品变性不彻底、有降解发生、修饰、上样过大等情况会导致拖带,凝胶不均匀、电泳装置渗漏、电压/电流过大、胶孔不平等原因会导致条带弯曲,当很小分子量的蛋白电泳到接近凝胶下沿时也会出现条带扭曲。