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lable-free定量蛋白质组学常见问题与解答

  • Q:Label-free定量的原理是什么?

    非标定量法( Label-free) 是通过比较质谱分析次数或质谱峰强度,分析不同来源样品蛋白的数量变化,认为肽段在质谱中被捕获检测的频率与其在混合物中的丰度成正相关, 因此蛋白质被质谱检测的计数反映了蛋白质的丰度,通过适当的数学公式可以将质谱检测计数与蛋白质的量联系起来,从而对蛋白质进行定量。按照其原理主要分为两种:一种是基于LC-MS/MS的肽段母离子的峰面积AUC(Area Under the Curve),另一种方法为谱图计数(Spectral Counting)。基于AUC这种方法由于使用了实际色谱响应的离子流峰,结果相对更准确,是当前主流的方法。

  • Q:Label-free定量的技术特点是什么?

    Label-free技术无需标记,操作简单;不受比较样品数限制;对实验操作稳定性、重复性要求高;但准确性较标记定量略低;要求至少做三次技术重复或生物重复。

  • Q:Label-free为什么可以比较不同类型样本?

    这是由于Label-free 的定量原理决定的,Label-free为非同位素标记技术,样品内没有同位素标签,每个样本单独酶解后,依次独立进行色谱分离和质谱分析,后续通过比较不同样本中相应肽段的信号强度,来对肽段对应的蛋白质进行相对定量,所以无论任何样本类型,只要是同一蛋白或基因,都可以比较。

  • Q:HPLC分级的作用是什么?是否组分越多通量越高?

    HPLC分级可以降低每个组分中蛋白的复杂度并增加每个组分中每个蛋白的含量,从而利于质谱的鉴定。我们需依据样品的复杂程度进行分级,分级数太少,会起不到降低样品复杂度的作用,而分级数目过多,反而会降低每个组分中每个蛋白的含量。

  • Q:为什么说Label-free较iTRAQ准确性较低?

    当样本过于复杂, 相近的m/z太多,导致一级质谱无法有效区分,最终导致峰面积提取异常,产生定量不准。