技术支持

荧光素酶报告基因检测常见问题与解答

  • Q:荧光素酶报告基因检测主要有哪些用途?

    a.启动子结构分析,将启动子区域序列(通常2k左右)进行分段截短,或对特定位点进行突变,再分别构建入luciferase报告载体,检测其启动子活性。

    b.启动子SNP分析,一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性,可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。

    c.验证特定转录因子同其调控序列的作用,将该序列(通常为启动子区域)插入报告基因载体,同时在实验细胞中共转过表达该转录因子,可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。

    d.可以分析信号通路是否激活,将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体,在不同上游信号条件下,荧光素酶活性代表了通路的下游响应。例如在GPCR研究中,将cAMP response element(CRE)载入报告基因载体,构建稳定表达细胞株后,可以用于分析GPRC的激活与抑制剂筛选。又如,将HIF1α的响应原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株,可以用于低氧相关通路的研究。

    e.验证microRNA的靶序列,将待测的3’UTR序列插入报告基因载体,再共转入该microRNA,如果荧光素酶活性下降,则提示为其靶序列。

  • Q:在金开瑞做荧光素酶报告基因检测,需要提供什么?实验结果包括哪些?

    您需要提供:1.基因序列或模板,需提供详细的转录因子、目的基因或microRNA信息;2.实验细胞,金开瑞默认为使用293T细胞,

    实验结束后,金开瑞会为您提供实验流程及完整报告一份,包括实验原始数据、图片、分析结果等。

  • Q:荧光素酶作为报告基因相比于荧光蛋白有哪些优势?

    Luciferase的灵敏度相比于GFP提高10-100倍以上,同时具有更宽的动态范围,便于数值分析比较,不需要荧光显微镜,而且在活体实验中其荧光穿透性高于EGFP等荧光蛋白,同时由于没有内源活性、其本底信号很低。

    而GFP等荧光蛋白相比于荧光素酶的优势在于可以进行失踪定位,并且其观测不需裂解细胞,方便进行适时观察。

  • Q:海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶相比,相对活性如何?

    在氧、镁和ATP的存在下,萤火虫荧光素酶作用于甲虫荧光素,而来源于海洋腔肠(Renilla reniformis)的荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。双报告基因技术(Dual-reporter assays),结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试。

  • Q:双荧光素酶报告基因实验转染效率很低而且复孔重复不出来是什么原因?

    转染效率低的话可以从三个方面改善,首先要确保细胞状态是好的,通常我们选出处于分裂期的细胞,另外阳性对照您可以选择过表达的荧光蛋白质粒,还有就是DNA的质量尤为重要,最好是先酶切验证。

    这个实验检测结果很灵敏,有一定差异是正常的,通常只要确保它在一个数量级之内即可。如果差异超出这个范围可以从两方面改善,一是记住保持样本的均一性,二是加样要准确。