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噬菌体展示技术常见问题与解答

  • Q:噬菌体展示技术的原理是什么?用于构建抗体库有何优点?

    噬菌体展示技术通过将外源肽段和噬菌体衣壳蛋白融合展示于噬菌体表面,进行高通量筛选及富集,并对所需功能的克隆进行定性分析,该技术展示对象涵盖抗体、抗体片段、肽段、cDNA等。在对抗体库的研究中,噬菌体展示技术可对人和其他动物的B细胞抗体库进行体外建库筛选,避开了免疫和细胞融合等步骤从而缩短实验周期并增加了稳定性,该技术还具有筛选容量大、可发酵大量生产、方法简单等优点。

  • Q:噬菌体展示技术的可以应用于哪些研究方向?

    1) 蛋白/抗体:诊断、药物导航、蛋白质结构分析、人源化改造、科研抗体的定制;

    2) 多肽随机肽库:蛋白质-蛋白质(配受体、信息传递、拮抗/抑制剂等)、蛋白质-DNA、诊断、中和活性、药物及药物导航、酶及底物。

  • Q:金开瑞噬菌体库容及滴度检测的方法是什么?

    通过测序的方法验证库的多样性,用噬菌体感染TG1大肠杆菌检测噬菌体滴度。库验证方法如下:

    ① TG1抗体库容验证:梯度稀释TG1抗体库,涂布于SOBAG平皿,通过菌落技术,计算1ml TG1菌中的细菌个数需达到109-10。随机挑取50个克隆测序,无重复序列即可;

    ② 噬菌体抗体库验证:梯度稀释噬菌体,感染大肠杆菌以后涂布SOBAG平板,计算出的噬菌体库滴度至少达到1013pfu/ml。

  • Q:金开瑞所用的淘选方法有哪些?

    淘选方法主要有两种:磁珠标记和免疫管淘选,区别在于前者获得的阳性克隆更多,后者获得的阳性克隆偏少一些但亲和力更高,通常情况下,首选磁珠标记的方法进行淘选,根据结果再决定是否增加免疫管淘选的步骤。两种方法的基本原理均是借助抗原抗体特异性结合。

  • Q:淘选过程怎么保证筛去没有干扰的抗体又能保留想要的抗体?

    淘选的原理,其实也是借助抗原抗体之间的特异性反应为基础的实验过程,具体来讲,即噬菌体表面展示的抗体序列跟抗原之间的特异性结合,使得特异性抗体序列被不断富集出来,但是淘选过程中,10^12甚至更高滴度的噬菌体跟抗原之间肯定会有非特异性结合,所以淘选结束后,会再进行一次ELISA鉴定,将非特异性结合的抗体克隆排除掉。其次若同时有几个高同源的靶点需要区分,可设置封闭组,提前封闭掉交叉结合的阳性克隆,剩余噬菌体库再做特异性靶点的淘选。

  • Q:金开瑞噬菌体建库中及筛库中单克隆测序会分别测多少?

    1) 对于抗体库的评估,一般会随机挑取20-50个克隆测序,来评估抗体的多样性及滴度;

    2)对于淘选及ELISA检测后的阳性克隆,一般会挑ELISA结果最好的10-15个克隆进行测序。

  • Q:金开瑞最终获得的噬菌体抗体库有多少量?分装后怎样保证每管的覆盖度到达要求?

    最终获得的噬菌体抗体库有20~30ml,每管1ml分装。一般情况下,分装后每一管的菌克隆数只要超过库容的十倍以上,就可以保证所有的序列都出现了。假如免疫库是10^9次方,每管的菌液浓度只要超过10^10次方,就可以保证所有抗体序列均能覆盖了,建库以后的菌是从平板上面洗脱下来的,菌的浓度是非常高的,所以还是很容易达到的,基本都是只多不少。

  • Q:构建好的小鼠免疫抗体库是如何保存的?以什么形式交付给客户?

    是以噬菌粒的形式保存在宿主菌。TG1抗体库和噬菌体抗体库从后续保存而言,TG1菌液会更方便保存一些,TG1抗体库即是指,展示有抗体序列的噬菌粒保存在TG1这种宿主菌中,那么要做筛选之前,需要先制备成噬菌抗体库,我们会提供TG1菌和辅助噬菌体,当然如果客户想拿到库后立马使用,我们可以拿出一管制备成噬菌抗体库,可以够筛选大几十个项目了,剩余交付TG1,用于保存。

  • Q:金开瑞用的是哪种噬菌体?

    M13噬菌体,其他类型的噬菌体暂时不开展。

  • Q:用于筛选的抗原都有哪些指标?

    通过跑SDS-PAGE进行初步评估,需达到:纯度 90%以上,浓度 1mg/ml,淘选及检测1-2mg。融合标签尽可能小,如果实在避免不了使用的大标签,请同时提供带有相同标签相同表达系统的其他无关融合蛋白1-2mg,作为负筛选原;所有接收的外来样品,但凡可以实施质控实验的,我方均会再次质控进一步确定。