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引物合成常见问题与解答

  • Q:贵公司可合成多长的DNA,多长的RNA?

    合成DNA的长度为6~130个碱基;合成RNA的长度为8~35个碱基。当合成的DNA序列较长时,由于合成及纯化方法的限制,很难保证制品中每个序列都正确无误。此外需要说明的是:如果待合成序列比较特殊 (例如多个“G”连续出现等),合成收率相对较低,我们可能会根据具体情况加收费用;有时我们也可能无法合成订购的序列,此时本公司保留不接受定单的权利。

  • Q:一般的合成Oligo DNA的5' 和3' 末端有磷酸基团吗?

    没有,5' 和3' 末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,订货时请特别注明,此时需收取磷酸化 (PO4修饰) 的费用。

  • Q:合成的DNA应如何保存?

    干燥制品很稳定,-20℃下保存2年没问题。

    溶解后的DNA也请保存于-20℃,最好是分份保存,避免反复冻融。

    溶液中的Oligo DNA在常温下放置3~4天应该没问题,但最好不要放置一个星期以上。其寿命与容器、溶剂的灭菌程度有关。

  • Q:合成的RNA应如何保存?

    干燥制品如能存放于-80℃是最理想的,如不能请于-20℃保存,保存2年没问题。

    溶液状态的RNA最好保存在-80℃,如无条件,请保存于-20℃。

  • Q:已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?

    如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5), 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

  • Q:引物质量好坏的判断标准是什么?

    合成的引物和您的定单序列一致,而不是能否扩增出您所需要的产物。

  • Q:合成的DNA/RNA制品溶解后发现有少许沉淀,会影响实验结果吗?

    所有的制品纯化后都要进行脱盐,脱盐是使用C18柱进行的,偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果,请稍许离心后取上清使用。

  • Q:怎样对合成DNA/RNA制品进行定量、如何测定并计算OD值?

    由于核酸在260 nm附近有强吸收,因此常根据此性质,用紫外分光光度计测定核酸溶液在260 nm的吸光度值,据此对核酸进行定量,用OD值来表示。1 OD是指:置于光路长度为1 cm的比色皿中的DNA/RNA溶液,如果其在260 nm处的吸光度值为1,则称1 ml该溶液中溶解的DNA/RNA的量为1 OD。1个OD值的合成DNA/RNA的质量约为33 μg。将DNA/RNA溶液进行适当稀释,使吸光度测定值与样品浓度的关系在直线范围内,再根据原溶液的总体积与稀释倍数计算该溶液的总OD值。例如,一个200 μl的DNA/RNA溶液,如果对其进行6倍稀释,测定值为1.0时,则该溶液的总OD值为:0.2 ml×6×1.0 OD/ml=1.2 OD 。

  • Q:测定了制品的OD值后发现OD260/OD280<1.8,制品质量 (纯度) 合格吗?

    由于核酸在260 nm附近有强吸收,而蛋白质在280 nm附近有强吸收,从生物体内提取核酸时,常用OD260/OD280比值来评价核酸纯度 (比值在1.8~2.0之间),这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同,序列很短 (通常在20~30个碱基之间),其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同,由于各种碱基的摩尔消光系数不同,因此不同碱基构成的合成DNA/RNA制品的OD260/OD280比值也不同,例如当序列中C、T碱基的含量高时,该比值会大大低于1.8。此外,序列中碱基的排列顺序也影响该比值。所以不能根据OD260/OD280比值来评价合成DNA/RNA制品的纯度。

  • Q:使用3%的Agarose凝胶电泳合成Oligo DNA制品,发现有很多条泳带,为什么?

    Oligo DNA的电泳一定要使用变性PAGE电泳。Oligo DNA是单链DNA,容易形成复杂的立体结构,因此进行Agarose电泳时,容易出现多条泳带 (更无法用Agarose电泳进行定量了)。

  • Q:进行PAGE电泳时,长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置?

    A、G、C、T的组份不同,电泳速度不同;

    DNA的立体结构不同,电泳速度不同。 这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生,长链Oligo DNA之间差别越小。

  • Q:能否根据电泳带的亮度对合成的DNA/RNA制品进行定量?

    不能。因为EtBr是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA/RNA分子为单链,只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被EtBr染色。由于不同制品的序列不同,形成双螺旋的能力不同,因此染色能力不尽相同,也就不能根据EtBr染色带的亮度来对合成的DNA/RNA进行定量。

  • Q:为什么引物不能退火之后跑胶验证纯度?

    两条引物退火成功率达不到百分之百,里面会存在单链引物,引物退火后跑胶有杂链很正常,不能以此来判断单链引物纯度。

  • Q:引物片段退火后不能连接到载体上是什么原因?

    连接反应的引物如果没有5’磷酸基团,连接效率相对较低,但不是完全不能成功。如果磷酸化的产物还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果以及核对引物的设计方案,如果都没有问题就要考虑改善引物退火的条件以及连接反应体系。

  • Q:PCR产物经克隆后测序发现,引物处的碱基有错误,怎么办?

    因为引物纯度不可能是100%,因此,挑选克隆时,有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时,请重新挑选一个克隆测序,会得到正确的结果。

    如果挑选2~3个克隆测序情况还没改观,我们会免费重新合成引物。

  • Q:怎样才能保证Oligo DNA的正确性?

    合成Oligo DNA时,尽量选用高纯度级制品。

    避免使用过长的Oligo DNA,最好选用小于35 mer的合成DNA制品。

    进行克隆实验时,每次克隆都须进行测序验证,以保证序列的正确性,然后再进行进一步实验。进行蛋白表达实验时,尤其需要注意。

  • Q:平端的PCR产物难以克隆,为什么?

    由于一般的PCR用引物的5′ 末端都没有磷酸基团,因此,扩增后的PCR产物的5′ 末端也没有磷酸基团。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时,无法克隆进去;而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时,背景会极高。此时请对PCR产物的5′ 端进行磷酸 (PO4修饰) 化处理。

  • Q:合成的引物进行PCR反应时无目的带,怎么办?

    PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。

    1. 引物和模板是否配对,同源性有多大?

    2. 引物本身是否有立体结构,或者二条引物之间是否形成高次结构?

    3. PCR反应用试剂是否能正常工作?

    4. PCR仪是否工作正常?

    5. PCR反应条件是否合适?

    如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物。如果重新合成的引物也无法解决问题时,请把引物和模板寄送给我们公司,我们可以帮助摸索PCR反应条件。

  • Q:PCR扩增不出是引物有问题吗?

    基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术,各色各样的高温聚合酶,就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出,扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增, GC含量高的片段,非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。

    引物扩增不出,主要是下列两种情况比较常见:

    RT-PCR。请注意,很多基因通过常规RT–PCR方法是很难不增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。

    从基因组中扩增。一般情况下,基因在基因组中都是单拷贝,基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高,会影响反应体系中的Mg和pH。