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胶点/胶条鉴定常见问题与解答

  • Q:胶点/胶条鉴定,对蛋白量的要求是什么?

    一般情况下,考染能看得见的点都有机会鉴定出来;分子量在 2-5 万之间的蛋白质,鉴定成功率比较大;分子量过小的蛋白酶切位点少,合适的肽段(1000~3000 Da)就少,所以鉴定的成功率相对较低;而分子量太大的蛋白质,在同等质量的情况下,蛋白的摩尔数较少;而且查库时匹配肽段的覆盖率会比较低(因为整个蛋白质较大),从而影响鉴定的成功率。

  • Q:蛋白胶点鉴定时,2-DE采用银染染色的方法,是否会对后续的质谱鉴定产生影响?

    银染试剂里不要使用戊二醛,因为它会对蛋白进行修饰,这样会影响后续的蛋白鉴定。

  • Q:胶条鉴定的结果中有很多蛋白,怎么确定这些蛋白的含量高低?

    胶条鉴定是一种定性分析,不是定量分析。如需要知道蛋白在一个样品中含量高低,可以根据每个蛋白的谱图数量进行粗略估计,谱图数越多,说明该蛋白丰度越高。如要对多个样品的同一个蛋白的含量进行比较,则可选择iTRAQ或者label free法进行相对定量。

  • Q:胶条鉴定结果中,如何挑选可信蛋白?

    在胶条鉴定中,鉴定蛋白的标准是至少含有一个unique peptide,列表中都是鉴定到的蛋白,并给出相应的得分。您可根据得分,结合分子量、等电点等信息筛选目标蛋白。

  • Q:胶条项目,如何比较几个样品中共有蛋白质和特有的蛋白质?

    可利用文氏图进行分析比对。在地址http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html输入protein ID即可。

  • Q:胶点鉴定结果与跑出的双向蛋白图谱比较相差较大的情况下,该如何判断一个胶点中给出的几个甚至十几个点蛋白中哪个蛋白可信度最高?

    蛋白质谱鉴定是通过肽段归并到蛋白,因此有些鉴定到的蛋白可能是目标蛋白的同源蛋白或该蛋白的一亚基,而蛋白的人为或天然修饰、降解等情况都会影响该蛋白出现在胶图中的位置。一般来讲,Mascot鉴定得分越高,可信度就越高,其次可以结合分子量、等电点、肽段覆盖率等信息筛选可信度高的蛋白质。

  • Q:如何保证蛋白的鉴定质量?

    为了保证蛋白的鉴定质量,金开瑞是有一套过滤标准的:

    首先,对于肽段和谱图匹配的离子得分(Ion Score),Mascot会给出一个鉴定阈值(Identity Score),如果离子得分(ion score)大于鉴定阈值(identity score),则为可信的肽段匹配;低于阈值的肽段匹配,是不可信的,会被过滤掉。对于不同的离子得分,Mascot会根据候选肽段段的数目和得分来确定这个阈值,所以这个阈值并不是固定的某个值。

    为了保证蛋白的可信程度,还可以设置蛋白的特有肽段的个数(Unique Peptides),即唯一对应某个蛋白的肽段。只有当蛋白含有至少1个unique peptide就认为被鉴定到,同时会给出得分。