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酵母杂交技术常见问题与解答

  • Q:我该如何根据自己的研究需求选择酵母单杂还是双杂?

    1) 酵母双杂交系统主要用于研究蛋白和蛋白之间的互作;

    2) 酵母单杂交系统主要用于研究DNA和蛋白之间的互作。

  • Q:金开瑞提到的酵母单双杂通用文库是什么意思?

    金开瑞通过文库构建得到次级文库质粒,将文库质粒转化到Y187酵母宿主中,得到两种文库类型,可同时满足酵母单双杂公转筛库或酵母单双杂matting筛库。

  • Q:相对其他公司而言,金开瑞在酵母杂交业务上具有什么样的优势?

    从文库构建来说:

    • 文库构建方式灵活:根据样本的类型,提供的样本量等方面考虑,可采用smart,geteway,infusion体外重组和T4体外连接等方式进行文库构建;
    • 文库片段大小可控:根据客户想要研究的蛋白类型大小控制片段的大小,以提高筛选到目标蛋白的可能性。如白细胞介素,生长因子类的小分子蛋白;转录因子,信号通路类的分子量稍大一些的蛋白;
    • 单双杂文库通用:构建一种类型的文库,可同时用于单双杂筛选;

    对于文库筛选来说:

    • 筛库方式多样:可采用matting或共转的方式进行文库筛选;
    • 互作强弱可控化:提高(降低)筛选压力,用于筛选出强(弱)相互作用的蛋白。
    • 阳性结果进一步验证:文库筛选出的阳性结果,可进行点对点验证进一步排除假阳性。
  • Q:金开瑞酵母杂交主要有哪些业务?

    金开瑞酵母杂交的主要业务范围如下:

    1) 核酵母单/双杂文库构建;

    2) 膜酵母双杂交文库构建;

    3) 核酵母单/双杂文库筛选;

    4) 膜酵母双杂交文库;

    5) 核酵母单/双杂点对点验证;

    6) 膜酵母双杂交点对点验证。

    具体项目介绍可参考酵母单双杂交技术服务

  • Q:金开瑞所提到的三框文库和均一化文库具体指什么?与普通文库相比有什么优势吗?

    三框:氨基酸对应三个密码子,文库中CDNA的片段大小是随机的,读码框也是随机的,例如ATG,有可能是从A开始翻译,也有可能是从T或G开始翻译,这种情况下就只会出现一个正确的读码,三框通过人为的引入一个和两个碱基,使每个移码的基因都能正确的被读出来,这样得到的文库即为一个相对较为完整。

    均一化:组织样本中会有些基因MRNA含量会很高,而有些基因含量会很低。均一化主要是将高峰度的MRNA通过人为的处理将其在总样本中的占比降下来,这样低丰度的MRNA的占比自然就会升高。如果客户感兴趣的基因恰好属于低丰度mRNA,那么在实现MRNA的均一性后,文库筛选更有可能的筛出客户的目的功能基因。要注意的是均一化不建议用于研究特殊处理后的样本(如,病毒/细菌侵害,水胁迫等)。

  • Q:我想在做酵母杂交的同时做一下相关的辅助实验,不知金开瑞有没有平台?

    如果您想研究蛋白与蛋白之间的互作,可以与CoIP /GST-pull downM等实验同时进行;

    如果您想研究DNA和蛋白之间的互作,可以与EMSA/chIP等试验同时进行。

  • Q:如果诱饵可以直接激活报告基因,该如何处理?

    为保证诱饵蛋白功能的完整性,首先我们会考虑用3’AT/ABA进行背景抑制,但是由于这两种试剂对酵母生长具有较大的毒性,后续可能会影响文库筛选,因此在3’AT超过15mM,ABA超过1200ng/ml时我们会考虑将诱饵蛋白进行截断,通过查阅文献和相关数据库,截去转录激活的区域,需要注意的是,截去的这一部分很有可能会影响到互作结果。

  • Q:酵母单杂诱饵启动子我该选择全长还是核心区域?

    1) 全长:优点:更接近于自然条件下的启动环境;缺点:有时候过于长,导致构建具有一定的难度,更可能的产生自激活现象;

    2) 预测的核心元件(<20bp):优点:核心元件用于后续的EMSA验证试验,对核心位点进行突变验证启动效果是否减弱,相对全长启动子而言突变的区域较少操作更为方便;缺点:核心元件虽然是启动的核心区域,但是启动子的其他区域也可能是作为辅助元件而存在的,如果缺少这些部分就是非自然条件下的环境,可能产生假阴性;

  • Q:进行酵母杂交文库筛选时得到的阳性结果,而进行点对点验证却出现阴性结果,是什么原因造成的呢?

    可能有以下原因:

    1) 酵母杂交本身也是存在假阳性的情况,有可能这两个基因根本不互作,这样在进行单独的点对点验证时自然也不会产生互作;

    2) 有些互作为瞬时互作,在文库筛选时可能捕捉导了互作,而在两个基因进行单独验证时由于互作时间的原因,最终导致结果显示为阴性;

    3) 有些互作为间接互作,可能需要依靠第三个基因的作用,促进这两个基因的互作。