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【客户文章分享】利用基于iTRAQ-PRM的蛋白质组学技术研究辣椒对烟粉虱的抗性机制

信息来源：金开瑞 作者：genecreate 发布时间：2020-06-01 16:30:55

题目：Proteomic analysis by iTRAQ-PRM provides integrated insight into mechanisms of resistance in pepper to Bemisia tabaci
期刊：BMC PLANT BIOLOGY
合作技术：iTRAQ、PRM
研究背景
        烟粉虱是辣椒的主要食叶害虫，对辣椒的生长和产量造成严重损害。因此，研究辣椒对烟粉虱的抗性机理，育种和推广辣椒对烟粉虱的抗性品种尤为重要。然而，关于植物如何感知和防御害虫的分子机制非常有限。蛋白质组技术为研究植物对抗烟粉虱的生理反应所涉及的分子机制提供了一些见解。
技术路线
图1
        研究人员先通过筛选，挑选出了对烟粉虱高抗性和敏感性的植株；后将两种植株在烟粉虱环境下培养了48h，发现两种植株存在不同的表型差异；接着，研究人员利用蛋白质组学技术，找到了差异表型下的差异蛋白；然后通过生物信息学分析，分析了这些差异蛋白的生物学功能；最后，研究人员利用RT-PCR和基于质谱的PRM技术对差异蛋白进行了验证。根据上述结果，分析讨论了辣椒对烟粉虱的抗性的机理。
实验结果
1、烟粉虱处理后的表型变化
       在初步实验中，作者筛选了许多辣椒材料，并鉴定出两个辣椒基因型变种，它们显示出对烟粉虱的高抗性（RG）或敏感性（SG）。对两种基因型的抗性进行研究，发现高抗性(RG)的辣椒叶片呈深绿色，而敏感型(SG)的辣椒叶片呈浅绿色。两个品种间成年烟粉虱的沉降行为不同。烟粉虱在SG上的种群数量是在RG上的40倍左右。同样，SG的卵孵化率较高，而RG的卵孵化率较低(图2c)。因此，这两种基因型是研究辣椒对烟粉虱侵染的蛋白质组学机制的理想选择。
图2
2、iTRAQ定量蛋白质组学分析
        作者利用itraq定量蛋白质组学技术比较了正常组(RC)、高抗组（RG）、敏感组（SG）辣椒叶片在感染烟粉虱前后的蛋白差异表达情况，共鉴定了20,102个肽和2756个蛋白（至少两个高置信度的特征性）。比较组RC-SC、RB-RC、SB-SC差异蛋白韦恩分析结果如下图所示：在3个比较组中总共统计到了115种蛋白发生差异变化，其中有24种差异蛋白是高抗性品种中所特有的。
图3
        在找到这些差异蛋白之后，作者进一步对差异蛋白进行了功能分析。发现这些差异蛋白主要参与代谢过程，细胞过程，对刺激的反应等生物学过程。结合差异蛋白的上下调关系，作者认为细胞壁蛋白在内的相关蛋白提高了辣椒对烟粉虱病的耐受性，此外光合作用相关蛋白在辣椒对烟粉虱的抗性中也起重要作用。
图4
        为了进一步理清这些相关蛋白的上下游联系，作者分析了这些蛋白所参与的信号通路。通过KEGG通路聚类分析，作者发现这些差异蛋白多聚类在碳固定、亚麻酸代谢、光合作用等相关信号通路。根据GO功能和KEGG途径分析，作者认为参与刺激反应，抗氧化剂防御，光合作用和亚油酸代谢的多种蛋白质可能对烟粉虱的损害具有防御作用。
实验验证
        基于质谱的分析结果，作者在基因水平上采用了RT-PCR技术去验证差异蛋白的表达情况。在挑选的6个基因中，其中有4个基因的表达水平与蛋白变化一致，还有两个存在差异，这种差异可能归因于mRNA稳定性，内源性剪接，翻译调控，翻译后加工，蛋白质更新控制，蛋白质降解等等因素影响所致。
图5
      作者近一步挑选了与抗性相关的10个蛋白进行了PRM验证，其中，有8种具有MS /MS光谱和独特的肽，能够在质谱中被验证。通过PRM验证，作者发现其变化趋势与iTRAQ结果基本一致，验证了iTRAQ结果的可靠性。
图6
实验小结
        本文通过iTRAQ定量蛋白质组学方法，寻找了高抗性、敏感性及正常辣椒植株间，在烟粉虱侵染后的差异蛋白表达变化，找到了与抗性相关的一些关键蛋白和信号通路。然后借助PRM等技术手段，验证了组学结果的可靠性。结合实验结果和已有文献报道，提出了提高光合作用能增添植株烟粉虱抗性，植物防御代谢物的合成需要固定碳或增加光合活性，以弥补昆虫对叶面积的损失的观点。阐述了烟粉虱侵染辣椒后的防御反应机制，为辣椒烟粉虱病虫害的防治和辣椒的育种提供的新的方向。
相/关/服/务
        iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）是一种体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术，利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学中应用最广泛的高通量筛选技术。
        金开瑞蛋白质组学技术平台提供iTRAQ定量蛋白质组技术服务，具有灵敏度高、分离能力强、高通量等特点，已协助客户在Advanced Materials等期刊杂志发表多篇文章，单篇影响因子高达19+！
        靶向蛋白质组PRM（ 平行反应监测, Parallel Reaction Monitoring），是一种基于高分辨、高精度质谱的靶向定量技术，能够对目标蛋白质/肽段（以及含有修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段的精准定量。靶向蛋白质组扫描就像精准狙击，排除干扰，目标明确。
        四级杆（Q1）首先选出的目标肽段离子，进入碰撞室中打碎后，所有的碎片离子经过质量分析器产生一张高分辨的二级质谱图，通过提取其中的碎片离子信息即可实现目标肽段的定量。
        金开瑞蛋白质组学技术平台提供靶向蛋白质组PRM技术服务，具有定量准确、高通量、可同时监测50-100个分析物、高灵敏度和高重现性的特点。

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