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【客户文献解读】IF=7.543，多组学联用结合互作技术确定RPS4Y1是VKH疾病中重要的CsA和CS抗性基因

信息来源：金开瑞作者：genecreate 发布时间：2020-06-19 10:58:42

题目：Identification of Ribosomal Protein S4, Y-Linked 1 as a cyclosporin A plus corticosteroid resistance gene

期刊：Journal of Autoimmunity

影响因子(IF)：7.543

研究背景

皮质类固醇(CS)联合环孢素A (CsA)被广泛用于治疗自身免疫性疾病、自身炎症性疾病和移植排斥反应。然而，一些患者对联合治疗方案没有反应或产生耐药性。在Vogt-Koyanagi-Harada (VKH)疾病模型中，通过转录组学(RNA-seq)、蛋白质组学(iTRAQ)体外检测等一系列实验，以筛选和验证潜在的耐药分子。研究发现在CsA、Cs耐药和-敏感的VKH患者来源的CD4+ T淋巴细胞中共有1697个差异表达基因(DEGs)和21个差异表达蛋白(DEPs)。核糖体蛋白S4和Y-Linked 1 (RPS4Y1)被证实调节男性VKH患者CD4+ T淋巴细胞对CsA和CS的抗性。作者发现CLB可以通过抑制RPS4Y1逆转抗性。综上所述，确定RPS4Y1是VKH疾病中重要的CsA和CS抗性基因。

研究内容及结果

1. CsA和CsA耐药及敏感VKH患者CD4+T细胞的转录和蛋白谱分析

作者应用RNA-seq技术检测来自12例耐药患者及19例敏感患者分离的CD4+T淋巴细胞mRNA表达水平的差异。与敏感患者相比，作者发现1697个差异表达耐药患者的基因（DEGs）（1.2倍变化，FDR<0.05）。其中822个基因上调表达，875个基因下调表达（图1A）。

作者还运用蛋白质组学(iTRAQ)开展了类似研究，发现与敏感患者相比，在耐药患者中发现21个差异表达蛋白（6个上调表达，15个下调表达（图1C））（DEPs）（1.2倍变化，p<0.05）。OmicsBean对DEGs和DEPs进行了功能分析(GO及KEGG) (http://www.omicsbean.cn)。DEGs 的GO分析结果显示：4604个生物过程(BP)，499个细胞成分(CC)，631个分子功能的功能通路被富集出来；此外26条KEGG通路被富集出来（图1B）。DEPs 的GO分析显示422个BPs，93个CCs，38个MFs及 13个KEGG功能通路被富集出来（图1D）。从GO和KEGG富集出来的通路可以看到，差异基因及蛋白主要是与炎症和免疫功能相关的，如NF-kappa B、抗原处理和递呈及MAPK等途径。

图1 耐药和敏感VKH患者CD4+T细胞的转录组和蛋白质组分析

（A）火山图显示差异基因，与敏感患者相比，耐药患者的基因上调（红色）或下调（绿色）被认为是FDR<0.05，两者之间的倍数变化>1.2两组；

（B） GO和KEGG对DEGs的功能通路富集，p<0.05被认为是显著的富集；

（C）火山图显示与敏感患者相比，耐药患者中的蛋白质显著上调（红色）或下调（绿色）的DEPs被认为是p<0.05，且两者之间的倍数变化>1.2两组；

（D） GO和KEGG对DEPs的富集，p<0.05为显著富集。DEPs：差异表达蛋白质。

2. 转录组与蛋白质组联合分析

通过对两个omics数据集（242个无注释）的综合分析作者发现：RPS4Y1和HLA-DQA1在mRNA和蛋白质水平上差异表达（图2A）。与敏感患者相比，基因及蛋白层面结果均显示RPS4Y1在耐药患者中上调，而HLA-DQA1下调（图2B）。此外，生物信息学分析显示两个候选基因参与了45个重要BPs，9个CCs，4个MFs和1重要的KEGG途径（图2C）。GO富集分析显示两个基因的详细功能分类并对其进行展示（图2D）。

图2 转录组与蛋白质组学联合分析

（A） vene图重叠部分显示候选分子RPS4Y1和HLA-DQA1在两个omics数据集。

（B） RPS4Y1和HLA-DQA1mRNAs与蛋白的相关性。

（C）对RPS4Y1和HLA-DQA1进行富集分析，p<0.05为显著富集。

（D） GO富集的详细功能分类。

3. RPS4Y1是VKH病中一个潜在的CS a和CS抗性基因研究

针对多组学联合分析筛选到的两个基因，作者进一步通过RT-qPCR和PRM分别进行反向验证，检测结果显示：RPS4Y1和HLA-DQA1的蛋白表达趋势与转录组实验结果保持一致。RT-qPCR结果显示：RPS4Y1在男性耐药患者表达上调（图3A），PRM结果显示相同的表达模式（图3C和D）。另一方面，PRM结果显示耐药患者HLA-DQA1蛋白表达下降（图3C和D），与蛋白质组实验结果保持一致。RT-qPCR结果显示耐药与非耐药患者HLA-DQA1基因表达无显著性差异(P>0.05)。（图3B）。

图3 RPS4Y1和HLA-DQA1的验证

（A和B）RT-qPCR法检测RPS4Y1（A）和HLA-DQA1
（B）的mRNA表达，GAPDH做内参对照，11例男性耐药，10例男性敏感患者检测RPS4Y1，17例耐药，21例敏感患者检测HLA-DQA1检测。（C） PRM用于验证蛋白质RPS4Y1（男性患者）和HLA-DQA1的水平，用R/S比值表示两组间蛋白水平的倍数变化，R表示耐药患者S代表敏感病人。

（D） iTRAQ与PRM结果的比较。

4. RPS4Y1对CD4+T细胞体外抗CsA和CS的调节作用

根据组学及验证结果，作者推测RPS4Y1可能对CsA及CS耐药性有一定的调节作用并进行功能检测实验进行验证。

通过转染过表达慢病毒感染CD4+T细胞（来源于5个男性敏感病人），同时构建干扰siRNA进行干扰实验转染CD4+T细胞（来源于8个男性耐药病人）。作者通过流式细胞术检测IL-17+和IFN-γ+CD4+T淋巴细胞，ELISA实验检测IL-17和IFN-γ细胞上清含量。结果显示CsA和Dex对IFN-γ+CD4+T细胞量无明显影响（图4A和B）。沉默RPS4Y1后CsA和Dex对细胞数量有下调影响。

图4 RPS4Y1在体外调节CD4+T细胞对CsA和CS的抵抗

（A）流式细胞仪检测IL-17+和IFN-γ+CD4+T细胞占比；（B）ELISA法检测8例男性耐药患者CD4+T细胞培养上清液中IFN-γ的产生；

（C和D）（C）流式细胞检测IL-17+和IFN-γ+CD4+T细胞的细胞占比

（C）和（D）ELISA检测上清IFN-γ的含量。

5. CLB（苯丁酸氮芥）通过抑制RPS4Y1的表达进而抑制VKH患者对CsA和CS的耐药性

作者为探究CLB对耐药患者作用的机制探，对来自于9个男性抵抗者的CD4+T细胞进行不同方式的治疗分组：包括DMSO（对照）、CsA和Dex（处理组1）、CLB和CLB加CsA&Dex治疗（处理组2）。结果表明，与DMSO对照组相比，治疗组IFN-γ+CD4+T细胞占比明显升高；CLB加环孢素A和地塞米松治疗组降低，轻度CLB治疗组减少但无统计学意义（图5A）。同时，ELISA试验的结果也显示了同样的趋势（图5B）。与对照组相比，CsA和Dex药物处理组中IFN-γ+CD4+T细胞的数量占比及INF-γ的含量并没有受到影响（图5A和B）。IL-17+CD4+T细胞及IL-17的含量也没有显著性差异变化（图5A）。预示着CLB可能起着一个辅助的功能，并推测这种功能是由于抑制了RPS4Y1功能或者表达水平引起的。

作者进一步通过RT-qPCR检测证实与对照组相比，添加CLB药物处理后RPS4Y1的基因表达量下降，同时只添加CLB药物组的表达量最低（Fig.5C）。这种情况在蛋白层面同样得到了验证（Fig.5D）。作者同时观察到经CsA & Dex处理组样本中RPS4Y1基因及蛋白表达相对于DMSO对照组略微上调（Fig.5C 和D）。进一步通过挽救实验显示，CLB联合CsA、Dex治疗对IFN-γ+ CD4+ T占比率及IFN-γ的含量的抑制效果在加入RPS4Y1过表达后消失了（Fig5E-G）。综合以上结果显示：CLB通过抑制RPS4Y1的表达抵消VKH患者对CsA及CS的耐药性。

图5 CLB通过降低RPS4Y1的表达逆转VKH患者CD4+T细胞对CsA和CS的抗性。

（A）流式细胞检测IFN-γ+CD4+T细胞，（B）ELISA检测9例男性耐药患者经DMSO，CsA&Dex，CLB，CLB&CsA&Dex. 孵育后CD4+T细胞上清液中IFN-γ的产生

（C）RT-qPCR检测RPS4Y1的mRNA水平；（D）Western blot检测RPS4Y1的蛋白水平；

（E）Western blot检测RPS4Y1蛋白；

（F）流式细胞实验检测IFN-γ+CD4+T细胞的频率。

小结

作者确定RPS4Y1是CSa和CS抗性基因。并通过功能实验及挽救实验探索了关于RPS4Y1如何表达增加控制耐药。进一步的证据发现RPS4Y1在控制耐药性中的作用是通过对药物CLB辅助及RPS4Y1表达降低有关。作者的研究是专注于VKH疾病，但也可应用于其他环境CsA和CS抵抗，包括其他自身免疫性疾病或器官移植，为后续临床耐药基因的筛选及研究提供了鉴定的理论基础，具有极其重要的研究意义。

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