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    研究方案
miRNA可以与mRNA结合调节体内基因的表达,通过影响蛋白的表达、修饰、酶活性等来调节生命活动的进行。lncRNA作为体内的ceRNA,可以与miRNA结合起到调节基因表达的作用。研究lncRNA与miRNA的相互作用对于研究生命具有重要的意义。通过MS2-RIP和灵敏度更高的双萤光素酶技术,来研究lncRNA和miRNA的相互作用。

MS2-RIP

MS2-RIP技术主要是应用针对GFP抗体的Protein G磁珠把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。

技术流程

  • 载体构建及转染
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  • 细胞裂解液获取
    及磁珠的准备
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  • RNA结合蛋白免疫沉淀
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  • RNA纯化
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  • RNA反转录及cDNA验证
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  • 数据分析

案例展示

图. MS2- RIP实验原理图(表达Lnc-A的质粒富集miRNA1miRNA2的效率比不表达Lnc-A的MS2组明显提高。通过对照,说明MS2-A可以与miRNA1和miRNA2相互结合)


双萤光素酶报告系统

双萤光素酶报告基因通常是一个报告基因作为内对照,使另一个报告基因的检测均一化。金开瑞应用Promega 公司的双萤光素酶报告基因检测(DLR)系统,提供DLR 检测服务。

技术流程

  • 序列分析
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  • 合成或者扩增目的片段
    亚克隆至目标载体
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  • 报告基因质粒、转录因子共转染细胞
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  • 萤光素酶反应发光
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  • 结果分析

案例展示

图. 双萤光素酶和RIP验证lncRNA可以与miR-26a结合

(引自C Cao, Zhang T, Zhang D. et al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. )