基因服务&测序

一般，菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。   平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。这样既误时间，又浪费客户的样品。一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。   制作穿刺菌时，可在1.5 ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中,37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。

(1) 扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果。   (2) 必须进行胶回收纯化。   (3) DNA纯化在1.6~2.0之间，浓度50ng/µl以上。

如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR产物去除不干净导致。大多数所谓的PCR"纯化试剂盒"实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用。对于非特异扩增产物产物肯定是无法去除，而且通常它们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。

PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将目的条带切割下，然后纯化。使用凝胶回收试剂盒回收。产物用ddH2O溶解。

对于测序用质粒DNA的一般要求：   (1) DNA纯度高，1.6~2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等。   (2) 溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类或EDTA等螯合剂，否则将干扰测序反应的正常进行。

我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB，加入一个已知浓度的标准样品。电泳结束后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA的不同构型。   质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状的质粒（SC）的一条链断裂，变成开环状（OC）分子，如果两条链发生断裂，就变成线状（L）。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋（SC）迁移速度最快，其次是线状（L）分子，最慢为开环状（OC）分子。使用紫外分光光度计检测，或者用EB-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰，浓度检测的数值也是没有多少意义的。

对测序引物的一般要求：   (1) 特异性与测序模板结合，不能有多于4个碱基以上的错配现象   (2) 不能含有混合碱基   (3) 长度17~25碱基   (4) 纯度高，最好PAGE纯化   (5) 用ddH2O溶解，不要用TE缓冲液溶解。

测序引物与待测样品DNA分子只能有一个结合位点是测序成功的关键。如果测序引物在DNA模板分子上有不只一个的结合位点，将造成测序反应过程中引物链在几个结合位点处同时扩增，反映在测序峰图上将出现双峰或乱峰，无法读取序列。

PCR产物测序出现套峰现象，一般有以下几种原因：   (1) PCR用模板不纯或PCR用引物特异性不好，扩增出的产物除了目的片段外，还有与目的片段长度相近的片段，即使用凝胶电泳也无法分离开，这样的PCR产物测序结果是套峰。   (2) 结构上的原因，造成了PCR产物测序出现套峰的现象。PolyA/G/C/T以及原因不明的复杂结构的存在，都会出现测序结果套峰的情况。

在测序反应中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，归结其形成原因有以下几点   (1) 测序引物在模板上有两个结合位点形成套峰   (2) 模板不纯，如果是质粒或是菌液，原因是非单克隆，如果是PCR,原因为非特异性条带   (3) 模板序列的特殊结构，如poly结构、发卡结构等   (4) 引物降解，引物不纯，或引物的特异性不好

这里分四种情况：   (1) 的确找不到测序使用的引物序列。目前使用的测序方法是在ddNTP上做荧光标记，测序仪通过检测ddNTP上的荧光来读取序列，因为引物本身是不做荧光标记的，所测序列是从引物3' 末端后第一个碱基开始的，所以在测序结果上找不到测序引物的序列。如果是PCR产物，要想得到PCR引物的序列，可以将PCR产物进行双链测通或者将PCR产物克隆到载体上，用载体上的引物（注意此引物也不能离插入片段太近）测序   (2) 找不到克隆片段的扩增引物。原因可能是您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分不会十分准确   (3) 还有一种可能是您的插入片段的插入方向是反的，这时您不妨找一下您引物的互补序列   (4) 存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点导致只有一条引物参与扩增

众所周知，PCR扩增过程中会出现很多错配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象，但大多数分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的，在测序时，错配现象也就反映不出来了。因此，PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中，很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存在着一些错配的序列，和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象，在PCR反应时，请选用保真性能高的DNA聚合酶。

一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先，在PCR扩增过程中就可能产生错误，将片段克隆到载体中也有可能发生突变；其次，测序的准确率问题。 ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到您的最准确的序列，进行双向测序是很有必要的。只进行简单的单向测序，我们无法保证所测序列的完全准确性，这是由仪器的精度决定的。

客户需要将测序样品或引物（客户自带的）返还时，我们在发送测序报告的同时，按客户要求寄回样品或引物（客户自带的)。   2）对于没返回的测序样品和引物，公司负责保存二个月（从样品收到之日算起)，超过二个月还需测序的样品，请客户另行提供。

测序用引物要求非常严格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板结合，3' 端的几个碱基能完全配对，即使引物长达80~100多个碱基，只要调整PCR反应条件，也能成功进行PCR反应。   而测序用引物便不一样了，必须严格符合以下要求。本公司的测序用引物全用引物设计软件Oligo设计。在本公司测序时，我们可免费帮助设计测序用引物。   ●长度在15~25个碱基左右，一般选择20个碱基（根据GC含量作适当调整)，3' 端尽量选择G或C碱基（但不绝对），以增加与模板的结合能力。   ●Tm温度应选择50℃~70℃左右。   ●GC含量应选择在50%左右，尽量避开A、T、G、C的连续结构。   ●避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。   ●保证引物和模板100%匹配，特别是3'端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点。

在检查报告时，设备和我们的技术员都倾向于提供给客户一个单一的信号，所以在出现杂合的位置上给出的信号往往是比较强的一个信号。所以如果您的PCR样品上是存在杂合位点的，请在测序订单上注明，我们在修改报告时会加以注意。但如果在您预期出现杂合信号的位置上只有单一的信号，那么我们是不会人为将其修改为杂合位点的。出现这样的情况可能是在您的样品中杂合成份太少的信号强度不足以被检查到，也许有其他更加灵敏的检测手段可以满足您的要求。

超过6Kb的DNA片断用Shot Gun 进行测序准确并且节省时间， Shot Gun方法如下：   (1) 用物理方法打碎DNA   (2) 回收1~1.5K的片断   (3) 用核酸酶切平端，连接入载体   (4) 按照一定比例进行测序，保证每一个区段有3倍以上的数据   (5) 编辑所有测序数据   (6) 如果有缺少数据的区域，还需要补充测序，拼接成完整序列

ABI3730测序仪是采用AB公司配套的Big DYE Terminator cycle sequencing Kit，其准确性达到800碱基只有1个以下的错误，并且该测序仪对碱基的判读有一个自身的评判值（Quality Value），根据QV值的大小，也可以帮助我们来判断每一个碱基的准确程度

有的客户想用测序的方法检测点突变体，我认为该方法可靠性不高。主要有以下两个原因。首先，我们并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在。其次，在同一位置，不同碱基的信号强度一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比较较高时，也不一定能准确检测到突变的存在。   另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果进行处理时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。因此，当某处出现双峰时，测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样不利于突变体的检测。因此认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。