实验原理
膜体系酵母双杂是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统,该系统可用于膜蛋白-膜蛋白或膜蛋白-胞质蛋白之间的互作检测。
泛素是一种含76个氨基酸的保守蛋白,它经常作为降解信号连接在蛋白质的N端。泛素能被其特异性的蛋白酶(ubiquitin-specific proteases, UBPs)识别并从所连接的蛋白上切割下来,切割位点总是位于泛素蛋白的C端。
在酵母细胞中,泛素可以分成两部分单独表达,即其N端部分(NubI, 第1~34位氨基酸)和C端部分(Cub, 第35~76位氨基酸),后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA-VP16蛋白。
野生型NubI和Cub具有高亲和力,并且可以自发重组形成异源二聚体。但是当野生型NubI的第13位Ile被Ala或Gly取代后,NubI和Cub就不能自发结合,因此,NubG(I13G)和Cub-LexA-VP16只有依靠bait和prey相互作用进行连接形成完整的泛素分子,然后诱导UBPs识别并于其C端进行剪切,从而释放出转录因子LexA-VP16,最终启动核内报告基因(HIS3、ADE2、LacZ)的转录