实验原理
Pepincell™ Transfection Reagent for siRNA (货号 CT0101) 是一款新型性能优良的 siRNA 专用转染试剂， 可高效将siRNA 的进行胞内递送和介导基因沉默 。该产品创造性的改良了聚合物与小 RNA 的结合方式， 与常规阳离子聚合物相比具有更低的离子强度特性， 毒性极低， 同时具有稳定性好 、转染简单、易行 、重复性好等优点。
产品优势
高效转染：siRNA专用，基因沉默效率 >90%（HEK 293细胞）
低毒性：改良聚合物结构，离子强度低，对细胞更友好
操作简便：稳定性好，重复性高
适用范围广：对细胞覆盖度容忍度高，40% 覆盖率仍可高效转染。
适用于难转染细胞：如原代细胞
实验流程
小RNA转染试剂操作指南
| Timeline | Procedure |
Component |
96-well | 24-well | 6-well | |
| DAY 0 | Cell cuLture |
The cell were cuLtured for 12-24h， cell density 50-60% |
Adherent cell inocuLation |
1-4x 10^4 |
0.5-1x 10^5 | 0.25-0.5x 10^6 |
| DAY 1 | Transfection reagent dilution |
Dilute transfection reagent with PBS and Vortex |
PBS |
9.2μL |
46μL | 234μL |
|
Transfection reagent |
0.4μL |
2μL | 8μL | |||
| siRNA-Complex preparation | Add siRNA to Transfection reagent(diluted) |
Transfection reagent (diluted) |
9.6μL |
48μL | 242μL | |
| siRNA (10 uM stock solution) |
0.4μL (4 pmol) |
2μL (20 pmol) | 8μL (80 pmol) | |||
|
Total volume |
10μL |
50μL | 250μL | |||
|
Vortex then Incubate at RT for 20 min |
||||||
| siRNA-Complex dilution | Dilute siRNA-Complex with Opti-MEM Reduced Serum Medium |
siRNA-Complex |
10μL |
50μL |
250μL |
|
|
Opti-MEM Reduced Serum Medium |
90μL | 450μL | 1750μL | |||
|
siRNA-Complex (diluted) |
100μL | 500μL | 2000μL | |||
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Cell transfection |
Remove original medium，Add siRNA-Complex（diluted）to cells |
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DAY 2-4 |
Visualize/analyze transfected cells |
Incubate cells for 2-4 days at 37℃ then analyze transfected cells |
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结果展示
示例细胞：
Pepincell™ Transfection Reagent for siRNA 转染 siRNA 干扰稳定表达 Luciferase 细胞系Luciferase 敲低效率:
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Cell lines |
Target gene | Gene silencing efficiency |
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HEK 293 |
Luciferase | >90% |
|
GL 261 |
Luciferase | |
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4T1 |
Luciferase | >80% |
|
B16 |
Luciferase |
- 24 well plate transfected with 2 μL Transfection reagent & 20 pmol siRNA/well
常见问题与解答
Q1 :用100nM 的 siRNA 转染时只得到 50%沉默效率，我可以将 siRNA 的浓度增加到 200nM 甚至400nM 吗？
增加 siRNA 的浓度一般不能改进沉默效率，高浓度的 siRNA 将可能导致去靶作用和对细胞的毒性。siRNA 的高基因沉默效率来自于合理的设计，在 100nM 甚至更低的浓度都可能有 75%的沉默效率。另外，低的转染效率会导致低的沉默效率，建议您更进一步优化 siRNA 的导入条件。
Q2: siRNA 转染实验需要阴性对照吗？
是，阴性对照是 RNA 干扰实验中不可缺少的。由于在超过 200nM 的浓度下，siRNA 有可能会导致非特异性的压力反应，在实验体系中必需设置阴性对照。它能够帮助我们确认基因表达水平的降低是否是序列特异性的 RNAi 的结果。由于 siRNA 的合成方法和工艺以及转染试剂等因素可能导致广泛的基因沉默现象。如果没有阴性对照，研究人员很可能错误地将广泛的、非特异性基因沉默当作由 RNAi 引起的基因特异性沉默。
