蛋白抗体服务

重组蛋白在大肠杆菌中大量表达时，很容易在胞内形成不可溶的包涵体，为后期的纯化复性带来麻烦。而且，复性所得到的蛋白活性很低甚至没有活性。因此，提高重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达是十分必要的。 可以从以下几点进行优化： 1) 选择合适的宿主细胞； 2) 采用合适的融合标签表达； 3) 选择合适的质粒载体； 4) 优化培养诱导条件。

重组蛋白在大肠杆菌中表达很难准确折叠的主要原因是大肠杆菌的细胞质环境呈现还原性，不利于二硫键的形成。针对这一原因，研究人员对细胞内表达，主要还原途径的两个关键酶的基因进行突变。构建了有利于二硫键形成，蛋白准确折叠的感受态细胞。如origami（DE3）,origamiB（DE3）,Rosetta-gami（DE3）,shuffle等。

融合标签用于检测和纯化目的蛋白。有时也通过增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白转运到细胞周质中以提高目的蛋白的生物活性。在原核表达载体或蛋白序列中常添加一些可溶性标签，如GST、MBP、SUMO等。这些标签在宿主中表达的蛋白质会有高度的可溶性。在与外源蛋白质融合后，从而促进外源蛋白的可溶性表达。

影响原核表达的因素包括有：翻译起始位点、GC含量、mRNA二级结构、密码子的偏爱性、质粒载体的选择、基因或者蛋白的大小、外源基因对宿主有毒性、基因突变（移码突变）、培养诱导条件等。

1) 翻译后的修饰（post-translational modification）如磷酸化，糖基化均能增大分子量； 2) 翻译后蛋白的自我切割（post-translation cleavage）自身断裂会降低分子量； 3) 有的蛋白有好几种异构体（splice variants），每个异构体的分子量都不一样，注意区分； 4) 自身所带电荷量有关（the composition of amino acids (charged vs non-charged)）； 5) 多聚体（multimers -）会增大分子量。

您可以选择液态形式或者冻干粉形式发货，蛋白冻干需要收取一定的费用。冻干粉采用去离子无菌水复溶，完全溶解即可，具体浓度根据您的实验需求而定。

载体（vector），指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。载体的种类与宿主相匹配，根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。金开瑞主要是原核表达载体。

（1）目的基因获取 （2）质粒构建 （3）菌株筛选 （4）表达条件优化 （5）蛋白纯化

A 测序结果，包括序列和测序峰图片； B 质粒载体名称；C重组克隆质粒10ul或者表达质粒20ul浓度大于100ng/ml； D 质粒抗性； E克隆和测序的引物序列。

进行SDS-PAGE检测的时候蛋白的净电荷会影响迁移率。带电量高的蛋白会结合较少的SDS，因此阻碍了蛋白的泳动。富含脯氨酸的蛋白会在SDS-PAGE胶中移动得特别慢。但是如果蛋白的等电点在5-9之间，并且组成的氨基酸组分没有明显的偏好，那么目的蛋白迁移率与预期相差较远就很有可能不是由于凝胶电泳造成的。这个时候最好利用C-端或者N-端的标签进行Western Blot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而导致多条目的条带或者比预期小很多的条带出现。如果蛋白酶过高可以尝试换个缺陷菌株。

（1）所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性； （2）根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。 （3）构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。 （4）长期保存的pET重组子在高浓度甘油中会导致质粒不稳定。 （5）37 ℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30 ℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温（15－20℃）延长诱导时间可以使溶解性蛋白的产量达到最大。 （6）进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。

（1） 选择正确的表达载体与表达菌株，基于T7 启动子的载体（如pET 系列载体）应选用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 等菌株。不是基于T7 启动子的表达载体（如带有tac 启动子的pGEX、pMal 系列表达载体）应选用BL21 表达菌株。对细胞有毒性的蛋白，应该选用背景表达低、严紧调控诱导的菌株，如BL21(DE3)pLysS 菌株。 对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白，应该选用Rosetta(DE3) 等菌株。 （2）尝试不同的表达系统与菌株 不同的蛋白，对不同载体与菌株的偏好不同，如果某一表达系统无法通过优化诱导表达条件得到明显改善，可以更换其它的菌株或表达载体。 （3）表达条件的优化，选择不同的培养基。对于某些蛋白，在培养基中加入适量的葡萄糖（0.1%~0.5%），可以明显提高表达量。较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间，一般可以加快表达的速度，促进目的蛋白的积累，从而提高表达量。但是可能会降低可溶蛋白的表达量，形成包涵体。菌体的生长状态对蛋白表达有很大的影响，可以通过测量菌液的OD 值监测生长状态。对于大部分蛋白，应在菌液的对数生长期（OD ≈ 0.5）进行诱导。

无论是大肠杆菌的上清还是包涵体表达或者是其他系统表达菌不保证蛋白活性，对于大肠杆菌包涵体表达蛋白保证蛋白最终保存于不含变性剂的缓冲中，但是不保证活性。

包涵体一般为PH8.0的TE缓冲液，上清一般为PH8.0的NT0缓冲液。

初级文库和次级文库主要针对invitrogene getway系统而言。 初级文库：得到的dsCDNA两端添加B1,B2的接头后，通过BP反应构建到donor载体（PDONR221）上，得到的初级文库的同源臂通过重构命名为L1,L2，可以与有R1,R2同源臂的其他载体实现一步法构建，形成其他类型的文库，如核膜文库的转换； 次级文库：次级文库用的载体为PDEST22,包含同源臂R1,R2，将构建PDONR221的初级文库，通过LR反应，构建到PDEST22载体上，形成次级文库。 结论：金开瑞的文库主要采用的是直接构建到酵母杂交的文库质粒上，最终交付的为工作文库（即次级文库）。invitrogene getway构建的文库因涉及到初级和次级文库，费用会更高一些，而周期也会相对长一些。

Gateway： 优点： 1.cDNA采用单链直接合成后补齐缺口的方式获得，cDNA片段的长度可以控制到1500bp左右； 2.把文库构建到大肠杆菌，便于获得文库质粒； 3.方便一步法获得不同载体的次级文库； 缺点： 1.样本的需求量很大（一般需要10-20g样本），对于珍贵的样本没有办法实现。 2.文库构建的时间周期一般为4周，是SMART技术的一倍； 3.3’端的接头采取引物合成的办法带上去，同时3’端末端引物添加Biotin修饰减少5’端接头错误添加，但是依然有10%的概率会错误把5’端接头添加到3’端末端，且方向正确的接头添加的效率只有70%。 4.BP反应和LR反应效率最多是80%。 5.成本很高； Infusin体外重组优点： 1.可以把文库构建到大肠杆菌，便于获得文库质粒； 2.改进的Infusin体外重组相对于T4连接酶阳性率较高。 3.不需要酶切外源片段，避免含有相应酶切位点的样本克隆丢失。 4.改进的Infusin体外重组方案采取PCR扩增的办法获得线性化载体然后去甲基化的办法去除背景环形质粒，避免形成空载体转化子。 缺点：Infusin酶和长距离PCR扩增线性化载体的酶比较贵。

 关于文库片段长度，是可以按照客户要求进行调整的，700bp，1000bp甚至1500bp以上我们都是可以实现的。最重要的还是需要考虑后续的文库筛选，如果客户的待筛选的与诱饵互作的猎物蛋白大小在800bp左右的，可能会由于客户追求的大片段（1000bp以上）导致结果偏少，不能有效的为客户后续研究方向提供有力的依据。所以在客户提到片段大小时，约定好风险。目前我们合同中约定的是插入片段PCR鉴定80%在750bp以上，是一个相对适宜的片段长度。

均一化cDNA文库：是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中,且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。减少冗余转录物的拷贝而增加低丰度转录物的拷贝而构建的cDNA文库。简单说就是降低高峰度的核酸，这样低峰度核酸就会占比高一些。均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库的筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和分析。 均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库的筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和分析。现在，在构建均一化cDNA文库中至少有两种主要的观点。一种是基于复性动力学的原理，高丰度的cDNA在退火下复性速度快，而低丰度的cDNA复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组DNA在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过cDNA和DNA的饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度。 三框文库：氨基酸对应三个密码子，文库中CDNA的片段大小是随机的，读码框也是随机的，例如ATG，有可能是从A开始翻译，也有可能是从T或G开始翻译，这种情况下就只会出现一个正确的读码，如果客户感兴趣的基因恰好移码了，这样就会提前终止，筛选也不可能被筛出来。三框通过人为的引入一个和两个碱基，使每个移码的基因都能正确的被读出来。传统的三框文库均是通过引物的方式人为引入突变的，金开瑞采用载体改造的方式在载体上引入三个不同的读码框突变。这样的三框文库构建只用合成一份双链cDNA,cDNA的合成纯化均是在同样的反应条件下进行的，可以完全保证三框文库的片段长度，文库滴度等信息的完全一致性，减少三框文库的差异对筛选结果的影响。 金开瑞三框文库：传统的三框文库均是通过引物的方式人为引入突变的，金开瑞采用载体改造的方式在载体上引入三个不同的读码框突变。这样的三框文库构建只用合成一份双链cDNA,cDNA的合成纯化均是在同样的反应条件下进行的，可以完全保证三框文库的片段长度，文库滴度等信息的完全一致性，减少三框文库的差异对筛选结果的影响。

我们三框文库构建的双链cDNA是采用一套处理，处理量是单框的三倍，三个改造的不同读码框的酶切载体也是分别定量后混合做infusine连接的。所以理论上我们的三框处理的文库滴度是非三框处理的文库滴度的三倍。