实验原理
RNA pull-down是研究细胞内RNA与蛋白/RNA结合情况的技术。先将RNA进行标记(如生物素标记),再与细胞裂解液共同孵育,从⽽形成RNA-RNA/蛋⽩质复合物, 进而检测与之结合的RNA或蛋⽩质。复合物洗脱后,通过定量PCR(pull down PCR)或⾼通量测序(RNA pull down-seq)方法来鉴定目标RNA是否与某些RNA分子相互作⽤,通过western blot(pull down-WB)实验和质谱(pull down-MS)技术检测目标RNA是否与某些蛋白相互作⽤。
实验流程
试剂盒组分
常见问题
1.实验全程如何预防RNA降解?
实验使用的所有试剂耗材需经过去RNA酶处理。
2.RNA pull-down⼀定要体外转录合成RNA探针吗?
体外转录只是获得RNA的⼀种方式,相比化学合成纯度更高。所以pull-down实验⼀般是体外转录得到目的RNA。当目的RNA序列大于2000bp时体外转录就不太容易转录成功了,这时我们可以利用设计合成⼀小段目的RNA探针,通过探针与目的RNA结合,再与蛋白结合,便可绕过这个问题。
3.RNA在转录出来后,其OD⼀般都不高,可以使用吗?咋定量呢?
OD值不高可进行RNA纯化,即便不纯化在实验中多加⼀些RNA亦可。而定量问题⼀般会进行琼脂糖凝胶电泳检测,可以根据marker浓度来判断RNA的浓度。也⽤仪器测量RNA的浓度,但通过体外转录得到的RNA浓度都能达到2μg/μL以上。并且pull-down实验不需要多精确的定量,都会加入过量的探针。
4.关于样本处理:细胞裂解物裂解的时候要不要加蛋白酶抑制剂还有RNA酶抑制剂这些处理?细胞裂解物提取蛋白是要怎么处理?还是就是裂解细胞就行了?
细胞裂解需要加入蛋白酶和RNA酶抑制剂,最好能够进行超声处理。另外裂解蛋白的全程尽量在冰上操作。
5.lncRNA引物设计有什么注意事项么?或者说与普通的引物设计有什么区别么?
体外转录扩增的引物只需要在正向引物5端加⼊T7启动子序列即可。
6.想问下有推荐的银染试剂盒么?
赛默飞或者我们金开瑞的都可以。
7.质谱鉴定的蛋白主要是依据打分来进行筛选?
这个筛选多少分算有效?pull-down富集蛋白质谱分析后会剔除不可信蛋白,交付的都是可信蛋白,没有明确的打分。需要排序的话⼀般是根据鉴定蛋白特征性肽段的数目作为参考。
8.做lncRNA pull down+质谱⼀般会发现多个互作蛋白对吗?
对这多个蛋白,如何选择就哪⼀种继续研究下去? 不同的RNA结合蛋白数量不等,根据实际鉴定的蛋白进行筛选;筛选的原则是根据自己研究的方向或相关功能确定这类蛋白。
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