荧光素酶蛋白互补实验（LCA）
- 高灵敏
- 低背景
- 实时监测
- 非侵入性
服务特色
与其它蛋白质互作研究技术相比, 借助于烟草瞬时表达系统的荧光素酶蛋白互补实验(LCA)具有简单、灵敏、可靠、高效和低背景等优点, 并可轻松扩展为大规模蛋白质互作的筛选和验证研究。
服务介绍
荧光素酶蛋白互补实验（Luciferase Complementation Assay，LCA）用于判断两个蛋白是否能够互作，将荧光素酶蛋白的两个片段分别连接到两个不同的待测蛋白上，若两个蛋白能够结合，则荧光素酶蛋白得以补全酶解底物发出荧光。
服务优势
- 高灵敏度：LCA能够检测低至皮摩尔级别的蛋白质互作，这使得它非常适合于研究低丰度蛋白质的相互作用。
- 实时监测：由于荧光素酶催化反应迅速，且生物发光信号强，LCA能够实现实时监测蛋白质互作，无需固定或裂解细胞，从而减少了样品处理过程中的损失和变异。
- 非侵入性检测：LCA在活细胞内进行，不会破坏细胞结构，允许在生理条件下观察蛋白质互作，提供更真实的生物学环境下的互作信息。
- 动态范围宽：LCA能够覆盖广泛的互作强度，从弱到强的互作均可检测。
客户提供
由我司基因合成：
提供蛋白CDS序列即可。
客户提供模板质粒：
1、客户提供载体/模板：需要提供载体mcs测序报告/模板测序结果，如无测序报告则需另外收取测序费用，由金开瑞代为测序；
2、客户提供菌液：菌液量应≥0.5mL，放置一年以上的甘油菌需活化后送样；
3、客户提供质粒：质粒量≥5ug；
4、菌液和液态质粒均需冰袋运输。
最终交付
- 返还目的基因剩余质粒；
- 默认做3个阴性对照，1个实验组；
- 交付3片叶子照片；
- 结题报告以及全部原始数据。
服务说明
| 服务名称 |
服务内容 |
交付内容及标准 | 服务周期（工作日） |
| 荧光素酶蛋白互补实验(LCA) |
质粒提取 |
返还目的基因剩余质粒 | 15 |
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注射烟草 |
默认做3个阴性对照，1个实验组 | ||
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拍摄照片 |
交付3片叶子照片 |
案例展示
常见问题与解析 (Q&A)
A：确保荧光素酶的两个片段正确地融合到待测蛋白质上，且表达载体没有构建错误；提高细胞或生物体的转染或转化效率；增加细胞数量或生物材料量；确认底物新鲜且浓度适当。
A：减少非特异性结合，比如调整洗涤条件或使用适当的封闭试剂；确保细胞健康，避免细胞裂解导致的内源性荧光素酶泄露；设立没有预期互作的对照组，以确定背景水平。
A：标准化实验操作，确保每次实验的条件一致；引入内参控制，如β-半乳糖苷酶或GFP，用于标准化荧光素酶活性；多次重复实验，以统计学方法评估数据的一致性和可靠性。
A：通过Western Blotting等方法确认蛋白质的表达水平；确保实验条件适合蛋白质互作；考虑使用不同的蛋白质片段或突变体。
相关技术服务
| ▶ 双荧光素酶报告系统 | ▶ 酵母双杂交 | ▶ 酵母单杂交 | ▶ CoIP |
| ▶ DNA pull-down | ▶ EMSA | ▶ CUT&Tag | ▶ 亚克隆/载体构建 |
| ▶ RIP-qPCR | ▶ ChIP-qPCR | ▶ RNA pulldown | ▶ 双分子荧光互补（BiFC） |
| ▶ 植物亚细胞定位 | |||
相关资源
1、荧光素酶蛋白互补实验为什么选择烟草叶片作为实验材料？
● 易于转化与表达：烟草植物（尤其是本氏烟草，Nicotiana benthamiana）是植物分子生物学研究中常用的模式植物之一，因为它对于基因转化具有很高的效率，特别是通过农杆菌介导的瞬时表达系统。这使得LCA所需的重组荧光素酶片段可以在烟草叶片中快速、高效地表达。
● 叶片大且平展：烟草叶片较大且表面平展，适合进行局部的注射或浸润处理，便于进行农杆菌介导的基因转移，同时也有利于观察实验结果，如生物发光信号的检测。
● 快速的生理响应：烟草叶片在转化后24-48小时内即可观察到荧光素酶的活性，这反映了蛋白质的快速表达和互作，缩短了实验周期。
● 低背景荧光：烟草叶片本身不含或含有极低水平的内源荧光素酶活性，这降低了背景信号，提高了实验的信噪比，使得蛋白质互作的检测更加敏感和可靠。
● 适合大规模实验：烟草叶片的大面积和易操作性使其适合进行大规模的蛋白质互作筛选实验，尤其是在需要比较大量样本的情况下。
● 成熟的技术体系：由于烟草叶片在植物遗传转化和蛋白质表达研究中的广泛应用，已经建立了成熟的技术体系，包括高效的基因递送、蛋白质表达和检测方法，这为LCA的实施提供了便利。
● 经济可行性：烟草植物易于培养和维护，与动物细胞相比，其成本较低，适合长期和大规模的研究项目
2、荧光素酶蛋白互补实验在多个研究领域中展现出广泛的应用价值，主要包括哪些？
● 蛋白质互作研究：LCA能实时监测活细胞内蛋白质间的直接或间接相互作用，为理解细胞信号传导、复合体组装及蛋白质网络提供数据。
● 植物科学：LCA在植物激素响应、抗逆境信号转导等领域有所应用，促进作物改良和农业生产。
● 药物发现与筛选：通过检测特定蛋白质互作的变化，LCA可应用于高通量药物筛选，加速新药开发过程。
● 信号转导分析：LCA帮助揭示信号蛋白如何在细胞内相互作用并传递信号，深入探究信号转导通路的分子机制。
● 病原体-宿主互作：LCA在解析病原体感染机制、宿主防御反应及免疫应答中发挥作用，增进对感染性疾病的理解。
● 遗传疾病机制：通过研究疾病相关蛋白质的异常互作，LCA助力遗传疾病的发生和发展机理研究。
● 肿瘤学：该技术用于研究肿瘤发生、发展过程中的蛋白质互作网络，为癌症治疗提供理论基础。
3、荧光素酶蛋白互补实验通常与其他实验技术联用，以增强实验的准确性和全面性，或者从不同角度验证和补充实验结果。
以下是一些常见的与LCA联用的实验技术：
● 免疫共沉淀（Co-IP）：Co-IP是一种经典的蛋白质互作检测方法，通过抗体特异性地富集目标蛋白及其结合伙伴，随后通过SDS-PAGE和Western Blotting进行分析。与LCA联用可以验证蛋白质互作的真实性，并提供互作蛋白的直接证据。
● 荧光共振能量转移（FRET）：FRET技术通过检测两个荧光基团之间的能量转移来监测蛋白质间的近距离相互作用。与LCA结合使用可以提供互作蛋白间距离的信息，进一步确认蛋白质复合体的结构特征。
● 质谱分析（MS）：在LCA检测到蛋白质互作后，通过质谱分析可以鉴定出互作蛋白的具体种类，提供蛋白质组学层面的信息，有助于构建详细的蛋白质互作网络。
● 酵母双杂交（Y2H）：Y2H是一种在酵母细胞内检测蛋白质互作的方法，特别适合于大规模筛选未知互作蛋白。与LCA联用可以相互验证，特别是在高通量筛选后的验证阶段。
● 细胞图像分析：通过荧光显微镜或共聚焦显微镜观察细胞内蛋白质定位和分布，与LCA联用可以提供蛋白质互作的空间信息，了解蛋白质复合体的亚细胞定位。
● 基因沉默技术（siRNA/shRNA/Crispr-Cas9）：通过基因沉默技术降低特定蛋白质的表达水平，可以研究该蛋白在蛋白质互作网络中的作用，与LCA结合使用可以进一步探讨蛋白质互作的功能意义。
● ChIP-seq：针对转录因子的研究，Chromatin Immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) 可以确定转录因子在全基因组范围内的结合位点，与LCA联用可以深入理解转录因子复合体的构成和作用机制。
