双荧光素酶报告系统

双荧光素酶报告系统

  • 检测周期短
  • 性价比高
  • 稳定性好
  • 准时交付

服务特色

金开瑞应用Promega公司的双荧光素酶报告基因检测(DLR)系统,提供DLR检测服务。

服务介绍

双荧光素酶检测是转录调控研究中十分重要的实验手段,主要应用于启动子和转录因子,以及miRNA和其靶基因互作的验证。

在双荧光素酶检测中,将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因,海肾荧光素酶作为对照报告基因。实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达,而对照报告基因作为内对照。

以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶活性,荧光素酶可以催化荧光素,在荧光素氧化的过程中会发出生物荧光,然后通过化学发光仪测定。

服务优势

  • 灵敏度高:比Western blot灵敏度高1000倍以上
  • 无报告基因: 植物、哺乳动物中无报告基因内源性表达
  • 不受物质影响:荧光素酶检测不受细胞内其它物质影响
  • 检测方便/范围广:检测范围广,大于7个数量级

服务流程

序列评估、靶点预测
基因合成
载体构建
细胞转染
双荧光素酶实验
数据分析

客户提供

基因模板,需提供详细的转录因子、目的基因、或microRNA信息;

实验细胞,如无特殊要求,金开瑞默认为使用293T细胞,则无需提供。

最终交付

  • 实验流程及完整报告一份,包括实验原始数据、图片、分析结果等。

服务说明

服务名称 服务内容 交付内容及标准 服务周期(工作日)
动物双荧光 靶点基因合成 含400bp以下,>400bp见附加单项 20
质粒提取 返还目的基因剩余质粒
mimics合成 注:仅验证miRNA需合成mimics
细胞转染 默认做4组,每组5生物学重复
双荧光素酶检测 交付结题报告及原始数据
植物双荧光(定量) 质粒提取 返还目的基因剩余质粒 20
注射烟草 每片叶子上做4组,设5生物学重复
双荧光素酶检测 交付结题报告及原始数据
植物双荧光(定性+定量) 质粒提取 返还目的基因剩余质粒 20
注射烟草 每片叶子上做4组,设5生物学重复
拍摄照片 交付3片叶子照片
双荧光素酶检测 交付结题报告及原始数据

产品推荐:双荧光素酶检测试剂盒

案例展示

双荧光素酶报告系统

常见问题与解析 (Q&A)

Q:荧光素酶报告基因检测主要有哪些用途?

a.启动子结构分析,将启动子区域序列(通常2k左右)进行分段截短,或对特定位点进行突变,再分别构建入luciferase报告载体,检测其启动子活性。
b.启动子SNP分析,一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性,可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。
c.验证特定转录因子同其调控序列的作用,将该序列(通常为启动子区域)插入报告基因载体,同时在实验细胞中共转过表达该转录因子,可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。
d.可以分析信号通路是否激活,将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体,在不同上游信号条件下,荧光素酶活性代表了通路的下游响应。例如在GPCR研究中,将cAMP response element(CRE)载入报告基因载体,构建稳定表达细胞株后,可以用于分析GPRC的激活与抑制剂筛选。又如,将HIF1α的响应原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株,可以用于低氧相关通路的研究。
e.验证microRNA的靶序列,将待测的3’UTR序列插入报告基因载体,再共转入该microRNA,如果荧光素酶活性下降,则提示为其靶序列。

Q:荧光素酶作为报告基因相比于荧光蛋白有哪些优势?

Luciferase的灵敏度相比于GFP提高10-100倍以上,同时具有更宽的动态范围,便于数值分析比较,不需要荧光显微镜,而且在活体实验中其荧光穿透性高于EGFP等荧光蛋白,同时由于没有内源活性、其本底信号很低。 而GFP等荧光蛋白相比于荧光素酶的优势在于可以进行失踪定位,并且其观测不需裂解细胞,方便进行适时观察。

Q:海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶相比,相对活性如何?

海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶相比,相对活性如何? 在氧、镁和ATP的存在下,萤火虫荧光素酶作用于萤火虫荧光素,而来源于海洋腔肠(Renilla reniformis)的荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。双报告基因技术(Dual-reporter assays),结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试。

Q:双荧光素酶报告基因实验转染效率很低而且复孔重复不出来是什么原因?

转染效率低的话可以从三个方面改善,首先要确保细胞状态是好的,通常我们选出处于分裂期的细胞,另外阳性对照您可以选择过表达的荧光蛋白质粒,还有就是DNA的质量尤为重要,最好是先酶切验证。 这个实验检测结果很灵敏,有一定差异是正常的,通常只要确保它在一个数量级之内即可。如果差异超出这个范围可以从两方面改善,一是记住保持样本的均一性,二是加样要准确。

相关资源

1、在双荧光素酶报告系统研究中,一些常用网站、数据库和资源库的简介

    ● Promega(promega.com):Promega是一个提供生命科学研究相关产品和服务的公司。他们提供多种荧光素酶底物和相关试剂盒,供科研人员在双荧光素酶报告系统实验中使用。

    ● Addgene(addgene.org):Addgene是一个非营利性的生物资源库,提供了广泛的质粒和表达载体,包括荧光素酶相关的质粒,供研究人员用于基因转染和表达。

    ● NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov):NCBI(美国国家生物技术信息中心)提供了包括PubMed、GenBank、Gene等在内的多个数据库,可用于搜索和获取与双荧光素酶报告系统相关的文献、基因序列和蛋白质信息。

    ● PubChem(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov):PubChem是NCBI的一个化学物质数据库,提供了大量的化合物信息和相关的生物活性数据,可以用于荧光素酶底物的筛选和选择。

 

2、双荧光素酶报告系统的实验步骤简介

①细胞培养和处理:

    ● 准备和处理目标细胞,确保其在适当的生长状态下进行实验。
    ● 维持适当的培养条件,包括培养基成分、温度和湿度等。

 

②底物处理:

    ● 加入荧光素酶底物和葡萄糖氧化酶底物以触发荧光发光反应。
    ● 优化底物浓度,确保使用浓度适当,以获得稳定且可检测的荧光信号。

 

③信号检测:

    ● 使用合适的设备进行荧光或发光信号的检测。
    ● 选择适当的检测方法,如荧光成像仪、荧光分析仪或酶标仪。 

 

④数据分析:

    ● 进行相对荧光单位的定量分析,并设置负对照和正对照组。
    ● 使用合适的数据分析方法,评估实验结果的特异性和可靠性。

 

⑤实验重复和统计显著性:

    ● 进行足够的实验重复以确保结果的可靠性。
    ● 根据需要进行统计学分析,以评估数据的显著性和可靠性。

 

⑥实验条件控制:

    ● 保持实验条件的一致性,包括细胞培养条件、培养基配制、底物制备等。
    ● 严格控制实验的时间点和温度,确保实验操作在合适的时间窗口内进行。

 

⑦数据报告和结果解释:

    ● 撰写实验报告或论文,清晰地呈现数据和结果。
    ● 结合相关背景知识和文献,解释实验结果的意义和可能的机制。

 

3、除了双荧光素酶报告系统实验,还有哪些常用于研究基因表达调控和信号通路活性的实验方法?

① 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP):

    ▶ 使用特异性抗体将目标蛋白与其相互作用的分子(如蛋白质复合物或DNA序列)结合,并通过沉淀、洗涤和分析来鉴定和定量这些相互作用。

 

② 染色质免疫沉淀(ChIP,ChIP-seq):

    ▶ 利用特异性抗体将某个蛋白质与染色质中的靶标位点结合,并通过免疫沉淀和测序技术,鉴定和分析该蛋白质在基因组上的结合位点及其调控作用。

 

③ 蛋白质互作分析:

    ▶ 利用蛋白质交联、共沉淀和质谱分析等技术,鉴定和分析蛋白质之间的相互作用关系,从而揭示基因表达调控和信号通路中的蛋白质网络。

 

④ 基因组学和转录组学分析:

    ▶ 利用高通量测序技术,如RNA-seq、ChIP-seq和ATAC-seq等,全面分析基因表达、染色质状态和转录因子结合位点,揭示基因调控网络和信号通路的动态变化。

X
返回顶部
在线咨询
拨打电话