服务介绍
实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)/qRT-PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光标记物，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对未知模板进行定量分析的方法。一般用于mRNA转录水平的定量研究、不同样本或基因组中DNA拷贝数的测定、基因芯片结果验证、药效分析等。
服务优势
- 高灵敏度和高特异性：通过荧光信号的实时监测，可以精确定量目标DNA序列的丰度，具有高灵敏度和高特异性。
- 快速和高通量：qRT-PCR反应时间相对较短，可以在较短时间内完成大量样品的分析，适用于高通量实验。
- 定量范围广：qRT-PCR可以在非常低的目标DNA浓度范围和非常高的目标DNA浓度范围内进行定量，具有广泛的定量范围。
- 可靠性和准确性：通过内部标准和质量控制，可以减少样品间和批次间的变异性，提高结果的可靠性和准确性。
- 多功能性：qRT-PCR可以应用于基因表达分析、病原体检测、突变分析、miRNA研究等多个研究领域，具有广泛的应用潜力。
服务流程
客户提供
样品及尽可能详细的背景信息（如物种信息，扩增目的基因NCBI登录号，相关文献和样品来源等）。
样品：组织应不少于100 mg；
细胞10^6-10^7个细胞；
细胞或组织裂解液总RNA浓度须大于1 mg/mL，单个样品不少于50 μL；
cDNA不少于30 μg。
（组织需液氮速冻、细胞收获后加入Trizol保存于-80度。样品用干冰寄送。避免各类污染和反复冻融。）
最终交付
- 溶解曲线、Ct值及完整实验报告；
- 实验报告内容包括所提取RNA浓度、荧光定量PCR原始数据及分析结果；
- 荧光定量PCR完整的实验步骤、使用仪器、软件设置参数等。
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 服务周期(工作日) |
|
荧光定量PCR (Real-time qPCR) |
普通引物合成(客户提供特异性序列) | / |
| 普通引物设计+合成+特异性筛选 | 3-5个 | |
| LncRNA、circRNA设计+合成+特异性筛选 | 6-8个 | |
| MicroRNA引物(客户提供颈环和qPCR特异性序列) | 12-16个 | |
| MicroRNA颈环引物设计+合成+特异性筛选 | 12-16个 | |
| RNA提取及逆转录 | 2-3个 | |
| 荧光定量PCR(不限RNA种类) | 实际样品数量来定 |
相关资源
1、荧光定量PCR（qRT-PCR）的实验步骤
● RNA提取：从样品中提取RNA，确保RNA的质量和纯度。常用的RNA提取方法包括酚/氯仿法、硅胶膜柱法等。
● cDNA合成：使用逆转录酶（reverse transcriptase）将RNA转录成cDNA。反转录反应中需要引物（primers）、逆转录酶和逆转录缓冲液。反转录酶会合成相应的cDNA，该cDNA包含了RNA样品中的目标序列。
● qPCR反应设置：将反转录产生的cDNA与引物和荧光探针（如TaqMan探针、SYBR Green探针）一同加入PCR反应混合物中。引物是专门设计的DNA片段，用于特异性扩增目标序列。荧光探针可以结合到扩增产物上，发出荧光信号。
● PCR扩增：通过多个循环的温度变化，即PCR扩增过程，使目标序列在DNA模板中进行扩增。PCR反应的循环包括变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）阶段。
● 荧光检测：在PCR反应的延伸阶段，荧光探针会与目标序列结合，发出荧光信号。这些信号可以通过荧光检测仪器实时监测。
● 数据分析：通过荧光信号的强度和PCR循环数，可以计算出目标序列的初始量或相对丰度。数据分析方法包括阈值循环数（Ct）法、标准曲线法等。
2、qRT-PCR实验结果不如预期可能的原因以及相应的解决方案
| 实验结果不如预期 |
可能的原因 |
解决方案 |
| 低信号强度或不可检测的信号 |
样品中的目标RNA浓度过低 |
检查RNA提取方法和效果，重新提取样品或调整稀释倍数 |
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引物或探针的设计问题 |
重新设计引物或探针，确保与目标序列的特异性 | |
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PCR反应条件不合适 |
优化PCR反应条件，调整温度和时间以提高扩增效率和信号强度 | |
| 高背景噪音或非特异信号 |
引物或探针的特异性问题 |
重新评估引物或探针的特异性，确保与目标序列的特异性 |
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污染或污染物干扰 |
检查实验室环境和试剂纯净性，确保实验无菌和无污染 | |
| 异常的CT值或差异表达结果 |
实验重复性问题 |
增加实验重复次数，提高实验的重复性 |
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数据处理问题 |
审查数据处理方法和参数，确保分析的准确性 | |
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样品异质性 |
分析样品中的异质性来源，如细胞亚群的存在或组织中不同细胞类型的混合 |
3、qRT-PCR在生物学和医学研究中一些具体的应用领域和示例：
● 基因表达分析：qRT-PCR可以用于定量测量基因的表达水平，帮助研究人员了解基因在不同条件下的变化。例如，可以使用qRT-PCR分析药物处理后特定基因的表达变化，如药物治疗后癌症相关基因的表达调控。
● 病原体检测：qRT-PCR可用于检测和定量病原体（如病毒、细菌等）的存在和数量。例如，在临床实践中，可以使用qRT-PCR检测病毒感染，如COVID-19病毒的检测。
● 突变分析：qRT-PCR可以用于检测和定量DNA序列上的突变或多态性。例如，在遗传疾病研究中，可以使用qRT-PCR分析突变基因的表达变化，进一步了解突变对基因功能和疾病发展的影响。
● miRNA研究：qRT-PCR可以用于定量测量microRNA（miRNA）的表达水平，揭示miRNA在基因调控和疾病发生中的作用。例如，可以使用qRT-PCR分析特定miRNA在肿瘤中的表达变化，研究其与肿瘤发展的关系。
● 表观遗传学研究：qRT-PCR可用于研究DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传标记的变化。例如，可以使用qRT-PCR分析特定组蛋白修饰酶的表达水平，探索其在表观遗传调控中的作用。
