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知无不“研”| 一文读懂RNA pull down（内含讲座回放和限时活动）

信息来源：金开瑞 作者：genecreate 发布时间：2020-07-31 09:50:54

        RNA与蛋白质的相互作用是细胞生理过程得以实现的决定性因素之一。近年来，随着技术的改进和新方法的建立，RNA和蛋白质的相互作用研究取得了长足进步。目前科研人员已经鉴定了较多RNA上的蛋白质结合位点，也发现了许多蛋白质中的RNA结合结构域，并对它们的结构特征进行了比较详细的研究。这些为最终探明RNA和蛋白质相互作用的分子机制，从而从本质上认识相关的细胞生理过程打下了坚实的基础。
       RNA pull-down作为研究RNA与蛋白互作的核心技术，已成为研究焦点。RNA pull down是使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过WB实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用，或者结合MS筛选RNA结合的未知蛋白。
（图片来源于https://mp.weixin.qq.com/s?src=11&timestamp=1596086144&ver=2491&signature=hzHhXJa1Y9zfIfsop8dfex102z*onK8Er65*dwvfNBGTIdDx7gwjAvWyAVqjYH3qmBEDYJGO8bdCQtPsVNrnAF1BznSRuIGKZozI23XKrgUJTCjaKf*x*M8YJLbsAUIQ&new=1）
 
RNA pull down技术应用
 
癌症肿瘤相关调控机制研究
        LncRNA发挥功能的方式很广，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控。主要包括基因组表观遗传修饰、调控转录后翻译、发挥ceRNA、增强子RNA作用等，从而对细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、免疫等发挥调控作用。
        lncRNA能够通过对肿瘤细胞糖代谢、谷氨酰胺代谢和脂类代谢途径中的关键环节进行调节，导致肿瘤细胞对葡萄糖摄取增加、谷氨酰胺分解增强及脂质生成增加，从而促进肿瘤的发生和发展。目前，大多数lncRNA在肿瘤细胞能量代谢中的功能和调控机制尚不完全清楚，进一步认识和了解肿瘤细胞中与lncRNA相关的能量代谢异常表现出的恶性生物学行为，将有助于为肿瘤的诊断和治疗提供有效的证据及新的思路和途径。
        环状RNA（circular RNA，circRNA）是近来研究很热门的一种特殊的长链非编码RNA。研究发现，circRNA 在人体细胞中广泛表达，在转录后水平具有调控基因表达的重要功能，并且参与多种肿瘤和其他疾病的病理发展过程。
       circRNA大多由外显子序列组成，呈闭合环状结构，性质稳定，高度保守性，通过微小RNA“海绵”作用调控靶基因表达，与肿瘤的发生、发展相关。这些特性使circRNA有潜力成为肿瘤新型分子诊断标志物。通过竞争性与肿瘤相关微小RNA的结合，可以开发针对circRNA分子靶点的靶向治疗药。因此,circRNA在肿瘤转化医学研究中意义巨大。
多种人类疾病研究
       RBPs在转录后水平参与调控mRNA稳定性、LncRNA活性、应激、肿瘤发生发展、细胞凋亡等众多生物学过程，且与诸多人类疾病密切相关。因此，对RBPs-RNAs相互作用网络的研究和鉴定有重要意义。但由于RBPs作用方式复杂、功能多样性、作用空间位置多样化等原因，对其开展精确研究一直是一个重大挑战。RNA领域，尤其是非编码RNA研究的快速发展，催生了多种RBPs-RNAs相互作用鉴定技术。
 
RNA pull- down实验常见问题
RNA结合蛋白的亲和力不够
  • 可能的原因：1)结合缓冲环境没有优化；2)裂解不完全；3)磁珠用量不足；4) RNA探针用量不足
  • 解决方案：1)优化孵育时间、温度、盐浓度等条件；2)增加裂解液和蛋白上样量的比例；3)增加裂解液；4)增加磁珠或探针用量；5)确定生物素和涟霉亲和素效率     
 
RNA结合蛋白没有结合
  • 可能的原因：1)靶蛋白量不足；2)缓冲体系不对；3)RNA探针和蛋白的亲和力本来就低
  • 解决方案：1)增加上样蛋白量；2) 应用低盐体系；3)加入交联试剂
 
WB信噪比高
  • 可能的原因：1)阳性信号率低；2)一抗效率低；3)蛋白没有充分沽解
  • 解决方案：1)增加抗的量；2)用敏感度的化学发光液；3)用细胞裂解液预孵-抗；4)增加样品的量；5) 确定有没有其他可能的结合情况；6)增加裂解液用量 
          
结合的非特异性高
  • 可能的原因：1)缓冲环境没有优化；2)缓冲环境严谨性低；3)样品没有裂解完全和裂解体系没有优化  
  • 解决的方案：1)优化孵育时间温度盐浓度等条件；2)使用严谨性高的缓冲体系；3)调低RNA探针和样品的比例；4)提高裂解液的量
案例展示
 
案例一
题目：The STAT3-Binding Long Noncoding RNA lnc-DC Controls Human Dendritic Cell Differentiation
小结：RNA pull-down设置实验组及反义链对照组，银染找出差异条带进行胶条质谱鉴定，分析结果筛选得到STAT3蛋白，进一步通过RIP-qPCR反向验证，证实STAT3蛋白可以与lnc-DC结合。
Lnc-DC pull-down 银染检测及RIP验证Lnc-DC与STAT3互作
 
案例二
题目：The long noncoding RNA THRIL regulates TNFα expression through its interaction with hnRNPL
小结：先用Linc1992全长进行RNA pull-down实验，通过WB检测手段分析四个意向蛋白中筛选得到一个差异蛋白α-hnRNPL，通过分段RNA pull-down及WB分析核心结合区域，主要是Linc1992的1-699和1406-2012区域，通过RIP-qPCR反向验证，证明α-hnRNPL蛋白可以与Linc1992结合。

Linc1992 pull down-WB筛选差异蛋白同时结合RIP验证Linc1992与α-hnRNPL 互作
 
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