2021年小金与您有个约定！

 
一、酵母单杂交
酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具，被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控，如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 
二、核蛋白酵母双杂交
核蛋白酵母双杂交技术最初由Fields等人在研究酵母转录因子GAL4性质时建立，后续经过不断改进已发展成为一种成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，具有简便、灵敏、可反映蛋白在活细胞内互作真实情况的特点，被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的鉴定/验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。

 
A为诱饵，B为猎物。
筛选涉及到的报告基因：
（1）HIS3。
（2）ADE2。
（3）MEL1。
诱饵质粒PGBKT7携带trp基因, ， 猎物质粒PGADT7携带Leu基因。
筛选涉及到的平板：DDO[SD/-Leu/-Trp]，DDO/X[SD/-Leu/-Trp/X-α-gal]，TDO /X [SD/-Leu/-Trp/HIS3/X-α-gal]，QDO /X[SD/-Leu/-Trp/HIS3/Ade2/X-α-gal]
 
1、诱饵自激活验证

 
分析：诱饵质粒重组质粒PGBKT7-A和猎物空载PGADT7共转化Y2Hgold酵母菌株。（1）涂布DDO平板能够生长，说明诱饵PGBKT7-A+ PGADT7已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性；（2）涂布TDO平板，不能生长，说明诱饵PGBKT7-A+ PGADT7无自激活现象，不能激活宿主菌报告基因his的表达；（3）涂布QDO平板没长，说明诱饵PGBKT7-A+ PGADT7无自激活现象，没有激活报告基因ADE2。
 
2、共转验证——阴阳性对照
 
3、共转验证——实验组
 
 
分析：诱饵重组质粒PGBKT7-A和猎物重组PGADT7-B共转化Y2Hgold酵母菌株。（1）涂布DDO平板能够生长，说明诱饵PGBKT7-A+ PGADT7-B已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性；（2）涂布TDO平板能生长，说明诱饵PGBKT7-A+ PGADT7-B能够互作，激活了宿主菌报告基因HIS3的表达；（3）涂布QDO平板能长，说明诱饵PGBKT7-A+ PGADT7-B能够互作，同时激活了报告基因HIS3和ADE2的表达。
 
4、双杂点种图
 

 
1自激活: Y2H[PGBKT7-A+ PGADT7]
2实验组: Y2H[PGBKT7-A+ PGADT7-B]
3阳性对照: Y2H[pGBKT7-53+pGADT7-T]
4阴性对照: Y2H[pGBKT7-lam+pGADT7-T]
 
5、酵母单杂点对点验证示意图
 
P为诱饵启动子，B为猎物。
单杂筛选报告和抗性基因：
AbAr/ AUR-C，AUR1基因的一个显性突变版本，编码肌醇磷酸化神经酰胺syn- thase酶。AUR1-C在Y2HGold/ Y1HGold酵母株中表达，是由于蛋白质与蛋白质的相互作用，使GAL4转录激活和DNA结合域接近。可以添加ABA进行背景抑制。,
诱饵质粒PABAI携带Ura基因，猎物质粒PGADT7携带Leu基因。
筛选所用到的平板：SD/- Leu，SD/- Leu/+AbA

 
 
自激活结果分析：PGADT7空载转化含诱饵启动子PAbAi-PY1Hgold酵母菌株。
（1）涂布SD/-Leu平板能够生长，说明诱饵PAbAi-P已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性；
（2）涂布SD/-Leu/AbA(100ng/ml)， SD/-Leu/AbA(200ng/ml) 平板能生长，说明200ng/ml的AbA不能抑制报告基因AbAr/ AUR-C ；
（3）涂布SD/-Leu/AbA(500ng/ml) ，SD/-Leu/AbA(800ng/ml)，SD/-Leu/AbA(1000ng/ml)平板没长，说明能够抑制报告基因AUR1-C的最低AbA浓度为500ng/ml，后续可用AbA(500ng/ml)进行共转验证。如果AbA最高抑制浓度1000ng/ml仍然能够生长，则只能考虑截短诱饵启动子。
 
6、共转验证——阴阳性对照
 
 
7、共转验证——实验组
 
 
分析：诱饵启动子重组质粒PAbAi-P转化Y1Hgold酵母菌株涂布SD/-Ura平板，挑取单克隆菌制备成感受态，将猎物重组质粒PGADT7-B转化到Y1Hgold【 PAbAi-P 】中。（1）涂布SD/- Leu平板能够生长，说明猎物重组质粒PGADT7-B已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性；（2）涂布SD/- Leu /+AbA (500ng/ml)平板能生长，说明诱饵PAbAi-P + PGADT7-B能够互作，激活了宿主菌报告基因AbAr/ AUR-C的表达。
 
8、单杂稀释点种图
 
 
1. 转化效率高，较少假阴性；
2. 设置严格的对照实验，排除假阳性和假阴性；
3. 酵母双杂系统采用多个报告基因，且每个报告基因上游调控区各不相同，可大幅度减少假阳性；
4. 报告基因整合到染色体上，使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性；
5. 严格设置点种验证实验菌体生长状态，进一步验证是否互作及互作强弱；
6. 严格保存原始实验数据便于溯源。