ELISA可以用来检测样本中特定蛋白或细胞因子含量，同样也是可以用来检测外泌体中一些标志性蛋白。ELISA试剂盒检测的样本是有多种类型的，如血清、血浆、尿液、细胞培养上清或组织匀浆液等，对于不同的样本，前期的处理方式也是不同的， 对于ELISA实验的来说，实验样本的处理非常关键。在处理过程中，使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测成分。在净化过程中加入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去除全部有机溶剂。同时要对尽量去除待测样本中的杂质，以防干扰实验结果。

正常情况下，血清中外泌体的含量还是很高的。一般常规实验血清纯化外泌体，建议可以先对外泌体进行鉴定，通过电镜检测观察一下外泌体的是否具有杯状结构，然后通过NTA检测一下粒径大小和粒径浓度，确定没问题进行再进行WB验证。 WB实验失败的一些原因：（1）抗体染色不充分，可以增加抗体浓度，延长孵育时间进行改善。（2）检查酶是否失活，可以直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。（3）可以增加阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有，则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可以增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。（4）检查抗体是否失效，看抗体是否过期，工作液尽量现配现用。

目前外泌体蛋白提取的方法相对较少，有的可以通过购买试剂盒来购买提取外泌体蛋白。在一篇专利中提到如何提取血清中的外泌体，专利申请号：CN201810287204.6 专利名称：提取外泌体及外泌体蛋白的方法 提取外泌体方法步骤：所得含有外泌体的材料(即洗涤后的沉淀)置于冰上，向其中加入18μL4g/100mL的SDS水溶液，然后超声(超声条件在100W下进行)裂解20分钟，得到超声产物；将超声产物在16000g下离心5分钟，收集全部上清液；向上清液中加入82μL 8M尿素水溶液和二硫苏糖醇，得到裂解液，该裂解液中二硫苏糖醇的浓度为20mmol/L；将该裂解液在37℃孵育4小时，得到裂解产物；将裂解产物转移至FASP管中，用8M尿素水溶液洗涤(FASP管是一种按分子量截留的管，洗涤过程都是通过离心完成，离心条件为14000g离心10分钟，离心以后，绝大部分溶液和小分子物质被离心至下层接收管子里，外泌体被截留在上层的FASP管中)2次；然后加入碘乙酰胺(终浓度50mmol/L)，室温下避光反应1小时，用50mM碳酸氢铵水溶液洗涤3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小时，将所得溶液45℃热干，用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容，得到外泌体蛋白提取液，将外泌体蛋白提取液上样进行LC-MS/MS分析，上样量为1μg。所得含有外泌体的材料(即洗涤后的沉淀)置于冰上，向其中加入18μL4g/100mL的SDS水溶液，然后超声(超声条件在100W下进行)裂解20分钟，得到超声产物；将超声产物在16000g下离心5分钟，收集全部上清液；向上清液中加入82μL 8M尿素水溶液和二硫苏糖醇，得到裂解液，该裂解液中二硫苏糖醇的浓度为20mmol/L；将该裂解液在37℃孵育4小时，得到裂解产物；将裂解产物转移至FASP管中，用8M尿素水溶液洗涤(FASP管是一种按分子量截留的管，洗涤过程都是通过离心完成，离心条件为14000g离心10分钟，离心以后，绝大部分溶液和小分子物质被离心至下层接收管子里，外泌体被截留在上层的FASP管中)2次；然后加入碘乙酰胺(终浓度50mmol/L)，室温下避光反应1小时，用50mM碳酸氢铵水溶液洗涤3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小时，将所得溶液45℃热干，用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容，得到外泌体蛋白提取液，将外泌体蛋白提取液上样进行LC-MS/MS分析，上样量为1μg。

超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。本实验室通过超速离心法提取植物外泌体，有的外泌体粒径大小在200nm左右，提取的浓度在正常范围内。一般在样本前处理步骤最后一步经0.22微米滤膜过滤，除去较大的囊泡，再进行超离即可。或者可以选用试剂盒或者尺寸排阻方法提取外泌体。

1. 超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，也是普遍认可的一种方式，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。 优点：无需特殊试剂，操作简便，适合大批量样本。 缺点：耗时耗力，纯度相对较低，回收率不稳定，重复离心会一定程度损伤外泌体，设备要求高。 2. 抗体亲和（磁珠）法利用包被单克隆抗体的磁珠结合外泌体，外泌体表面有其特异性标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。 优点：纯度较高，特异性和重复性好、操作简便、无设备限制。 缺点：效率和回收率较低，仅能捕获表达特定抗原的目标外泌体，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，囊泡完整性影响较大。 3. 微流控指的是使用微管道（尺寸为数微米到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为纳升到阿升）的系统所涉及的科学和技术。这种方法具有分离生物颗粒速度快，纯度高，节省样本，集成度高等优点。因此，虽然微流控技术在外泌体分离方面的应用仍处于起步阶段，却已经成为了当前研究的热点。目前，近些年，基于微流控的外泌体分离技术也在不断出现。 4. 尺寸排阻色谱(SEC)是基于尺寸而非分子量分离大分子，尺寸排阻色谱可以精确地分离大分子和小分子。SEC主要用于分离血液和尿液中的外泌体，不过，这种外泌体提取方法需要很长时间，并且不适合处理大量样品。

外泌体鉴定可以通过电镜、粒径以及WB来进行，生物标志物可以选择CD63、CD9、CD81 以及TSG101、HSP70、ALIX，一般通过WB的方式验证外泌体是否含有一些标志性蛋白。

推荐使用华美公司的外泌体提取试剂盒来提取尿液中的外泌体，它能快速提取高质量高纯度的外泌体。目前主流的提取外泌体的方法都各有利弊：使用尺寸排阻色谱(SEC)是基于尺寸而非分子量分离大分子，尺寸排阻色谱可以精确地分离大分子和小分子。SEC主要用于分离血液和尿液中的外泌体，不过，这种外泌体提取方法需要很长时间，并且不适合处理大量样品。使用超速离心可以一次性获得较多外泌体，但是纯度不足；密度梯度离心法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂、耗时、量少； 抗体亲和（磁珠）法：纯度较高，特异性和重复性好、操作简便、无设备限制。缺点：效率和回收率较低，仅能捕获表达特定抗原的目标外泌体，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，囊泡完整性影响较大。

细胞培养液的量建议选择在合适的范围，但是目前尚未发现，培养液的量过多会影响外泌体的浓度。

外泌体装在分为两种：一个是内源装载：细胞可以产生外泌体，根据外泌体产生的过程，对细胞进行适当改造，让其产生携带目标分子的外泌体。 另外一种方法是外源装载：操作简单，稳定性更高，更适合放大化生产。目前，外源装载的常用方法有孵育、电穿孔、超声、反复冻融等。 孵育法操作简单，不会破坏外泌体膜的完整性，适用于装载疏水性小分子。电穿孔主要适用于装载亲水分子，装载效率较高。但是可能破坏外泌体膜的稳定性。超声法是利用探针超声仪对外泌体进行超声处理，使外泌体膜变形，产生瞬态小孔，增加膜的通透性，从而允许小分子物质扩散到外泌体中。装载效率高于电穿孔和孵育，但是对外泌体膜的损伤较大，可能导致外泌体破裂。