技术支持
TECHNICAL SUPPORT

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Q:为什么提供新鲜的菌液?如何提供新鲜的菌液?

首先,新鲜的菌液易于培养,可以获得更多的DNA,同时最大限度地保证菌种的纯度。如果您提供新鲜菌液,用封口膜封口以免泄露;也可以将培养好的4~5ml菌液沉淀下来,倒去上清液以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。

Q:DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?

溶解DNA测序样品时,用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应,需要一个最佳的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后,在进行测序反应时,DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件,造成Taq酶的聚合性能下降。   有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确,TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性,并且TE Buffer对DNA测序反应的影响也较小,但根据我们的经验,我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。

Q:提供DNA测序样品时,提供何种形态的比较好?

我们推荐客户提供菌体,由我们来提取质粒,这样DNA样品比较稳定。如果您可以提供DNA样品,我们也很欢迎,但一定要注意样品纯度和数量。如果提供的DNA量不够,我们就需要对质粒进行转化,此时需收取转化费。有些质粒提取法提取的DNA质量很好,象TaKaRa、Qiagen、Promega的质粒制备试剂盒等。   提供的测序样品为PCR产物时,特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物必须进行切胶回收,否则无法得到良好的测序效果。   有关DNA测序样品的详细情况请严格参照"测序样品的提供"部分的说明。

Q:提供的测序样品为菌体时,以什么形态提供为好?

一般,菌体的形态有:平板培养菌、穿刺培养菌,甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。   平板培养菌运送特别不方便,我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎,面目全非,需要用户重新寄样。这样既误时间,又浪费客户的样品。一旦是客户非常重要的样品时,其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。   制作穿刺菌时,可在1.5 ml的Tube管中加入琼脂培养基,把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中,37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月,并且不容易污染,便于运送。

Q:PCR产物直接测序有什么要求?

(1) 扩增产物必须特异性扩增,条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物,一般难以得到好的测序结果。   (2) 必须进行胶回收纯化。   (3) DNA纯化在1.6~2.0之间,浓度50ng/µl以上。

Q:为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化?

如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收,经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR产物去除不干净导致。大多数所谓的PCR"纯化试剂盒"实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用。对于非特异扩增产物产物肯定是无法去除,而且通常它们不能够完全去除所有的PCR引物,这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。

Q:如何进行PCR产物纯化?

PCR产物首先必须用Agarose胶电泳,将目的条带切割下,然后纯化。使用凝胶回收试剂盒回收。产物用ddH2O溶解。

Q:对于测序用的质粒DNA的要求有哪些?

对于测序用质粒DNA的一般要求:   (1) DNA纯度高,1.6~2.0之间,不能有混合模板,也不能含有RNA,染色体DNA,蛋白质等。   (2) 溶于ddH2O中,溶液不能含杂质,如盐类或EDTA等螯合剂,否则将干扰测序反应的正常进行。

Q:如何鉴定质粒DNA浓度和纯度?

我们使用水平琼脂糖凝胶电泳,并在胶中加入0.5ug/ml的EB,加入一个已知浓度的标准样品。电泳结束后在紫外灯下比较亮度,判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等,也可以鉴别抽提的质粒DNA的不同构型。   质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中,由于各种原因的影响,使得超螺旋的共价闭合环状的质粒(SC)的一条链断裂,变成开环状(OC)分子,如果两条链发生断裂,就变成线状(L)。这3种分子有不同的迁移率,通常,超螺旋(SC)迁移速度最快,其次是线状(L)分子,最慢为开环状(OC)分子。使用紫外分光光度计检测,或者用EB-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度,甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰,浓度检测的数值也是没有多少意义的。

Q:对测序引物的要求有哪些?

对测序引物的一般要求:   (1) 特异性与测序模板结合,不能有多于4个碱基以上的错配现象   (2) 不能含有混合碱基   (3) 长度17~25碱基   (4) 纯度高,最好PAGE纯化   (5) 用ddH2O溶解,不要用TE缓冲液溶解。

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