ELISA可以用来检测样本中特定蛋白或细胞因子含量，同样也是可以用来检测外泌体中一些标志性蛋白。ELISA试剂盒检测的样本是有多种类型的，如血清、血浆、尿液、细胞培养上清或组织匀浆液等，对于不同的样本，前期的处理方式也是不同的， 对于ELISA实验的来说，实验样本的处理非常关键。在处理过程中，使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测成分。在净化过程中加入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去除全部有机溶剂。同时要对尽量去除待测样本中的杂质，以防干扰实验结果。

正常情况下，血清中外泌体的含量还是很高的。一般常规实验血清纯化外泌体，建议可以先对外泌体进行鉴定，通过电镜检测观察一下外泌体的是否具有杯状结构，然后通过NTA检测一下粒径大小和粒径浓度，确定没问题进行再进行WB验证。 WB实验失败的一些原因：（1）抗体染色不充分，可以增加抗体浓度，延长孵育时间进行改善。（2）检查酶是否失活，可以直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。（3）可以增加阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有，则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可以增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。（4）检查抗体是否失效，看抗体是否过期，工作液尽量现配现用。

将microRNA装载到外泌体当中，可以考虑孵育，超声，挤压法，冻融法，或者化学转染的方法。这些方法可以使药物很容易进入外泌体的内部。在药物扩散后，外泌体的膜会重新恢复。 孵育法操作相对简单，不会破坏外泌体膜的完整性，适用于装载疏水性小分子。电穿孔主要适用于装载亲水分子，装载效率较高。但是可能破坏外泌体膜的稳定性。如果考虑成本还有装载效率可以选用孵育的方法，除此之外，还有以下方法可以用来装载microRNA. 1、超声方法，在超声过程中，利用超声和匀浆探针使膜变形，从而允许药物扩散到外泌体 2、挤压法，将外泌体和药物混合后通过一个只有100-400nm孔的膜，利用脂质挤压机将药物转入外泌体中。 3、冻融法，将外泌体-药物混合物在−80◦C或在液氮中反复冷冻几个循环，然后再解冻到室温，以确保药物的成功结合。 4、化学转染，外泌体和药物与表面活性剂孵育，导致膜上形成孔，从而渗透药物。最常用的表面活性剂是皂苷，因此这种方法也称为皂苷辅助负载法。

外泌体是内吞起源的细胞外纳米膜状囊泡，体液中循环的外泌体可以通过携带多种功能分子如lncRNA、miRNA、蛋白质等与受体细胞相互作用，介导细胞间通讯，从而影响肿瘤的发生发展。外泌体中检测到的lncRNA称为外泌体源性lncRNA。研究发现外泌体可通过向组织细胞转移肿瘤相关lncRNA，影响肿瘤的生物学进程，在肿瘤增殖、转移、侵袭、肿瘤耐药、肿瘤免疫调节及新生血管形成中发挥重要作用。此外肿瘤来源的外泌体具有转移前微环境的能力，在远处或特定部位转移lncRNA到受体细胞可以产生适合肿瘤细胞生长的转移前微环境。所以肿瘤组织的微环境改变，可能导致肿瘤组织中的的lncRNA含量也会产生变化。

目前外泌体蛋白提取的方法相对较少，有的可以通过购买试剂盒来购买提取外泌体蛋白。在一篇专利中提到如何提取血清中的外泌体，专利申请号：CN201810287204.6 专利名称：提取外泌体及外泌体蛋白的方法 提取外泌体方法步骤：所得含有外泌体的材料(即洗涤后的沉淀)置于冰上，向其中加入18μL4g/100mL的SDS水溶液，然后超声(超声条件在100W下进行)裂解20分钟，得到超声产物；将超声产物在16000g下离心5分钟，收集全部上清液；向上清液中加入82μL 8M尿素水溶液和二硫苏糖醇，得到裂解液，该裂解液中二硫苏糖醇的浓度为20mmol/L；将该裂解液在37℃孵育4小时，得到裂解产物；将裂解产物转移至FASP管中，用8M尿素水溶液洗涤(FASP管是一种按分子量截留的管，洗涤过程都是通过离心完成，离心条件为14000g离心10分钟，离心以后，绝大部分溶液和小分子物质被离心至下层接收管子里，外泌体被截留在上层的FASP管中)2次；然后加入碘乙酰胺(终浓度50mmol/L)，室温下避光反应1小时，用50mM碳酸氢铵水溶液洗涤3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小时，将所得溶液45℃热干，用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容，得到外泌体蛋白提取液，将外泌体蛋白提取液上样进行LC-MS/MS分析，上样量为1μg。所得含有外泌体的材料(即洗涤后的沉淀)置于冰上，向其中加入18μL4g/100mL的SDS水溶液，然后超声(超声条件在100W下进行)裂解20分钟，得到超声产物；将超声产物在16000g下离心5分钟，收集全部上清液；向上清液中加入82μL 8M尿素水溶液和二硫苏糖醇，得到裂解液，该裂解液中二硫苏糖醇的浓度为20mmol/L；将该裂解液在37℃孵育4小时，得到裂解产物；将裂解产物转移至FASP管中，用8M尿素水溶液洗涤(FASP管是一种按分子量截留的管，洗涤过程都是通过离心完成，离心条件为14000g离心10分钟，离心以后，绝大部分溶液和小分子物质被离心至下层接收管子里，外泌体被截留在上层的FASP管中)2次；然后加入碘乙酰胺(终浓度50mmol/L)，室温下避光反应1小时，用50mM碳酸氢铵水溶液洗涤3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小时，将所得溶液45℃热干，用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容，得到外泌体蛋白提取液，将外泌体蛋白提取液上样进行LC-MS/MS分析，上样量为1μg。

超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。本实验室通过超速离心法提取植物外泌体，有的外泌体粒径大小在200nm左右，提取的浓度在正常范围内。一般在样本前处理步骤最后一步经0.22微米滤膜过滤，除去较大的囊泡，再进行超离即可。或者可以选用试剂盒或者尺寸排阻方法提取外泌体。

1. 超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，也是普遍认可的一种方式，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。 优点：无需特殊试剂，操作简便，适合大批量样本。 缺点：耗时耗力，纯度相对较低，回收率不稳定，重复离心会一定程度损伤外泌体，设备要求高。 2. 抗体亲和（磁珠）法利用包被单克隆抗体的磁珠结合外泌体，外泌体表面有其特异性标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。 优点：纯度较高，特异性和重复性好、操作简便、无设备限制。 缺点：效率和回收率较低，仅能捕获表达特定抗原的目标外泌体，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，囊泡完整性影响较大。 3. 微流控指的是使用微管道（尺寸为数微米到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为纳升到阿升）的系统所涉及的科学和技术。这种方法具有分离生物颗粒速度快，纯度高，节省样本，集成度高等优点。因此，虽然微流控技术在外泌体分离方面的应用仍处于起步阶段，却已经成为了当前研究的热点。目前，近些年，基于微流控的外泌体分离技术也在不断出现。 4. 尺寸排阻色谱(SEC)是基于尺寸而非分子量分离大分子，尺寸排阻色谱可以精确地分离大分子和小分子。SEC主要用于分离血液和尿液中的外泌体，不过，这种外泌体提取方法需要很长时间，并且不适合处理大量样品。

白是膜蛋白，所以不能煮沸吗，其他的marker如HSP70，TSG101都跑出来了，想问一下有这回事吗？ 膜蛋白不宜进行煮沸，一般进行煮样后跑出来的条带很杂，不能被抗体很好识别，可能是因为有些抗体识别的是空间结构，而不是一维线性结构。

外泌体鉴定可以通过电镜、粒径以及WB来进行，生物标志物可以选择CD63、CD9、CD81 以及TSG101、HSP70、ALIX，一般通过WB的方式验证外泌体是否含有一些标志性蛋白。