1.从文库构建来说： （1） 文库构建方式灵活：根据样本的类型，提供的样本量等方面考虑，可采用smart，geteway，infusion体外重组和T4体外连接等方式进行文库构建； （2） 文库片段大小可控：根据客户想要研究的蛋白类型大小控制片段的大小，以提高筛选到目标蛋白的可能性。如白细胞介素，生长因子类的小分子蛋白；转录因子，信号通路类的分子量稍大一些的蛋白； （3） 单双杂文库通用：构建一种类型的文库，可同时用于单双杂筛选； 2.对于文库筛选来说： （1）筛库方式多样：可采用mating或共转的方式进行文库筛选； （2）互作强弱可控化：提高（降低）筛选压力，用于筛选出强（弱）相互作用的蛋白。 （3）阳性结果进一步验证：文库筛选出的阳性结果，可进行点对点验证进一步排除假阳性。

主要业务范围如下： 1.核酵母单/双杂文库构建； 2.膜酵母双杂交文库构建； 3.核酵母单/双杂文库筛选； 4.膜酵母双杂交文库； 5.核酵母单/双杂点对点验证； 6.膜酵母双杂交点对点验证。

（1）HIS3。Y2HGold不能合成组氨酸，因此不能在缺乏这种必需氨基酸的培养基上生长。当诱饵和猎物蛋白质相互作用时，Gal4-responsive His3的表达允许细胞生物合成组氨酸并在其最小的培养基上生长.可添加3’AT进行背景抑制。 （2）ADE2。Y2HGold也不能在不含腺嘌呤的最小培养基上生长。然而，当两种蛋白质相互作用时，Ade2表达被激活，使这些细胞在Ade最小培养基上生长。 （3）MEL1。MEL-1编码-半乳糖苷酶，一种在许多酵母菌中自然存在的酶。由于双杂交相互作用，α-galactosidase (MEL1)由酵母细胞表达和分泌。表达Mel1的酵母菌落在致变色底物X-α-Gal存在下变成蓝色。 （4）AUR1-C，AUR1基因的一个显性突变版本，编码肌醇磷酸化神经酰胺syn- thase酶。AUR1-C在Y2HGold酵母株中表达，是由于蛋白质与蛋白质的相互作用，使GAL4转录激活和DNA结合域接近。可以添加ABA进行背景抑制。, PABAI载体携带Ura3基因，PGADT7载体携带Leu基因，PGBKT7载体携带trp基因, 筛选所用到的平板：一缺：SD/- Ura， SD/- Leu /+AbA ； 二缺：DDO[SD/-Leu/-Trp]， DDO/X[SD/-Leu/-Trp/X-α-gal] ； 三缺：TDO [SD/-Leu/-Trp/HIS3]； 四缺：QDO[SD/-Leu/-Trp/-HIS3/-ADE2]

（1）PGBKT7载体用于构建核酵母双杂Bait-PGBKT7质粒或作空白对照。 （2）PGADT7载体用于构建核酵母双杂，单杂Prey-PGADT7质粒或作空白对照。 （3）PABAI 载体用于构建单杂Bait-PABAI质粒。 （4）PGBKT7-53质粒与PGADT7-T质粒作为核酵母双杂验证和筛选的阳性对照组。 （5）PGBKT7-lam质粒与PGADT7-T质粒作为核酵母双杂验证和筛选的阴性对照组 （6）pOST1-NubI 质粒与pBT3-N-bait质粒作为膜酵母双杂交验证和筛选的功能验证对照组； （7）pBT3-N载体用于构建N端位于胞质，C端位于细胞器腔内（或者胞外）诱饵蛋白； （8）pBT3-SUC载体用于构建N端位于细胞器腔内（或者胞外），且N端含有信号肽的诱饵蛋白； （9）pBT3-STE载体用于构建C端位于胞质，N端位于细胞器腔内（或者胞外），且N端不含信号肽的诱饵蛋白； （10）pBT3-N和pBT3-STE皆可N端C端均位于胞质的诱饵蛋白； （11）pPR3-C载体用于C端位于胞质，N端位于胞外或细胞器腔的猎物蛋白构建； （12）PPR3-N载体用于膜文库构建和不跨膜的猎物蛋白构建； （13）Ptsu2-APP质粒和pNubG-Fe65质粒作为膜酵母双杂验证和筛选的阳性对照组； （14）Ptsu2-APP质粒和PPR3-N质粒作为膜酵母双杂验证和筛选的阴性对照组 （15）Y187菌株：Clontech公司开发的GAL4系统酵母单杂，双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株（Y2HGold，AH109等）通过mating操作进行筛库试验。缺陷 trp1, leu2，报告基因为：lacZ, MEL1。 （16）Y1HGOLD菌株：Clontech公司开发的GAL4-AbA酵母单杂系统用菌株，MATα型，可直接转化质粒进行筛库试验。缺陷 ura3，leu2；报告基因为：AbAr。 （17）Y2HGold菌株：Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation  marker为: trp1, leu2，报告基因为：AbAr, HIS3, ADE2, MEL1。 （18）NMY51菌株:DUALsystems BioTech公司开发的检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂实验用菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株缺陷 trp1, leu2-3，报告基因为：HIS3, ADE2 和 lacZ

建库：总RNA提取——mRNA分离及纯化——双链cDNA合成及纯化——双链cDNA与PGADT7载体体外连接——大肠文库菌液——文库质粒——转化Y187酵母宿主——Y187酵母文库菌液 双杂筛选：（1）matting方式：诱饵重组质粒PGBKT7载体构建——诱饵重组质粒和PGADT7空载转Y2Hgold酵母宿主进行自激活验证——含诱饵的Y2Hgold酵母菌液与Y187酵母文库菌液进行混合——根据自激活结果涂布筛选平板——阳性结果点钟——阳性菌培养提质粒——PCR阳性鉴定——送测——测序结果分析 （2）共转：诱饵重组质粒PGBKT7载体构建——诱饵重组质粒和PGADT7空载转Y2Hgold酵母宿主进行自激活验证——文库质粒转化含诱饵的Y2Hgold酵母感受态——根据自激活结果涂布筛选平板——阳性结果点钟——阳性菌培养提质粒——PCR阳性鉴定——送测——测序结果分析 单杂筛选：诱饵重组质粒PABAI载体构建——线性化诱饵重组质粒和PGADT7空载转化Y1Hgold酵母宿主进行自激活验证——文库质粒转化含诱饵的Y1Hgold酵母感受态——根据自激活结果涂布筛选平板——阳性结果点钟——阳性菌培养提质粒——PCR阳性鉴定——送测——测序结果分析

凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，可用于定性和定量分析；目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，是转录因子研究的经典方法。 金开瑞提供EMSA检测技术服务，帮助您检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。

EMSA是用特定序列的标记探针，同待验证蛋白孵育后进行native-PAGE凝胶电泳，如果存在同探针结合的蛋白，则会出现电泳迁移率明显低于自由探针的条带出现。 DNA pull-down是将探针结合在凝胶/磁珠上，以此收集同该DNA探针发生互作的蛋白。ChIP实验中所检测的DNA-蛋白互作则发生在活组织细胞内。

使用天然组织细胞样本进行实验，通过抽提核蛋白获取目的蛋白，此为混合蛋白，如要确定某个蛋白结合于探针时，需要加入抗体观察是否形成超迁移条带。可以通过重组蛋白表达系统（如金开瑞的大肠、酵母、哺乳、无细胞等）获得特定的重组蛋白，后续实验中如出现迁移条带，则应源于该蛋白的结合作用。

可以通过启动子序列分析查找，确定探针设计范围，如果范围太宽泛，可以先将0.5-1kb片段克隆到荧光素酶报告载体验证其启动子活性以及是否受到该转录因子调控；寻找核心启动子可以通过分段截断验证。如果研究的转录因子具有已知的结合序列motif，则可以在该motif位点选择探针。也可以先进行ChIP或DNA pull down找到富集序列之后，再设计分段探针进行验证。