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专题讲座|经典互作,大有作为
文章来源:genecreate 作者:genecreate 发布时间:2019-12-31 16:35
        分子互作是生命体的普遍主题,分子互作技术是生命科学的基础技术。分子互作包含核酸与核酸互作、核酸与蛋白互作、蛋白与蛋白互作这三种类型。随着人类基因组计划的完成,后基因组时代的深入,测序、质谱、生物信息联合分析等技术的进一步发展,使得高通量筛选生物标记物、寻找生物关联分子变得可能,同时对分子互作技术的应用提出了更高的要求。
       金开瑞多年来致力于分子互作机制研究,组建了专门分子互作研究技术团队,拥有丰富的互作类项目设计、实施经验,可以为您提供核酸与核酸、核酸与蛋白、蛋白与蛋白间等各类从方案流程设计到技术实施的整套互作研究服务。
       本文将详细阐述这三种互作类型的原理及技术流程,让大家更好的理解吸收,助您科研成功,早日发文!
1、核酸与核酸互作
        miRNA可以与mRNA结合调节体内基因的表达,通过影响蛋白的表达、修饰、酶活性等来调节生命活动的进行。lncRNA作为体内的ceRNA,可以与miRNA结合起到调节基因表达的作用。研究lncRNA与miRNA的相互作用对于研究生命具有重要的意义。通过MS2-RIP和灵敏度更高的双萤光素酶技术,来研究lncRNA和miRNA的相互作用。
 
1. 1 MS2-RIP
       MS2-RIP技术主要是应用针对GFP抗体的Protein G磁珠把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。
技术流程
MS2-RIP
 
1.2 双萤光素酶报告系统
        双萤光素酶报告基因通常将一个报告基因作为内对照,使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞,带有实验报告基因的载体和带有不同报告基因的第二个载体共转染培养细胞。通常实验报告基因偶联到调控的启动子,研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关,偶联到组成型启动子的第二个报告基因,提供转录活力的内对照,使测试不被实验条件变化所干扰。
       金开瑞应用Promega 公司的双萤光素酶报告基因检测(DLR)系统,提供DLR 检测服务。
技术流程
双萤光素酶
2、核酸-蛋白互作
        蛋白与核酸的相互作用广泛存在于生命活动的调节中。基因的复制、转录、翻译、修饰等过程都离不开核酸和蛋白的互作。金开瑞提供RNA pull down+质谱、染色质免疫共沉淀、凝胶迁移或电泳迁移率检测(EMSA)、酵母单杂交、DNA pull down等技术来检测DNA/RNA与蛋白的相互作用。
 
2.1 RNA pull down
        蛋白质与RNA 的相互作用是许多细胞功能的核心,如蛋白质合成、mRNA 组装、病毒复制、细胞发育调控等。使用体外转录法标记生物素RNA 探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,通过WB 实验检测特定的RNA 结合蛋白是否与RNA 相互作用。若待检测目的蛋白明确,选择WB鉴定;若不明确,则可选择质谱鉴定。
       金开瑞现提供RNA pull down 检测技术服务, 使用特异性二抗进行检测,能有效避免抗体重链对结果的信号干扰。并且金开瑞配套自己的质谱平台,能显著提升检测效果。
技术流程
RNA pull down
2.2 DNA Pull down
        DNA pull down是用于分析蛋白质与DNA互作的一种分析技术。一般来说,该实验首先需要针对待研究目的基因的调控区域设计并制备特异性探针(以脱硫生物素标记为主流);同时,制备细胞核提取物;将探针和核提取物共同孵育,DNA结合蛋白就会和靶向序列特异性结合;然后,通过亲和素磁珠纯化蛋白质DNA复合物;最后针对获得的蛋白,使用WB验证或者质谱方式鉴定蛋白质类型。
技术流程     
DNA Pull down
 
2.3 RNA 结合蛋白免疫沉淀(RIP)
        RIP 技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA 结合蛋白免疫沉淀)主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,可以帮助我们发现miRNA 的调节靶点。
       根据客户需求,金开瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作验证RIP技术服务。
技术流程
RNA 结合蛋白免疫沉淀
 
2.4 染色质免疫共沉淀技术(ChIP)
        ChIP染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要通路的一种非常有效的工具。
技术流程
染色质免疫共沉淀
2.5 凝胶迁移或电泳迁移率检测(EMSA
        凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术,可用于定性和定量分析;目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用,是转录因子研究的经典方法。
       金开瑞提供EMSA检测技术服务,帮助您检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、特定的蛋白质,并可进行未知蛋白的鉴定。
2.6 酵母单杂交(Y1H)
        将提取的样品RNA 逆转录成单链cDNA,经长距离聚合酶链反应扩增得到双链cDNA,再经CHROMA SPIN TE-400 柱子纯化后与酵母表达载体pGADT7-Rec 线性质粒共转至Y1HGold[pBait-AbAi]酵母感受态,经SD/-Leu/AbA 缺陷培养基筛选出与诱饵序列相互作用的猎物蛋白。
技术流程
酵母单杂交
 
3、蛋白-蛋白互作
        蛋白是生命活动的执行者,可以以单一分子或者复合体形式执行生命活动。蛋白分子间相互作用是蛋白分子组建复合体、执行功能的一个途径。金开瑞可以提供免疫共沉淀、GST pull down、酵母双杂交技术检测蛋白分子间的相互作用。其中,免疫共沉淀实验结果具有更接近真实生理条件下蛋白相互作用信息的优点,配合GST pull down,可以研究蛋白之间是直接相互作用还是间接相互作用,而酵母双杂对于研究低表达的蛋白、瞬时表达蛋白具有更高灵敏度的优点。
 
3.1 免疫共沉淀 (Co-IP)
       免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是将样品中同抗体靶蛋白相互作用的蛋白一同随免疫复合物沉淀,然后进行检测的技术。通过免疫共沉淀可以检测两种目标蛋白质是否在体内存在相互作用(直接或者间接),免疫共沉淀后通过质谱技术也可以寻找一种蛋白在体内的相互作用蛋白。
        金开瑞现提供IP 和Co-IP 检测技术服务, 使用特异性二抗进行检测,能有效避免抗体重链对结果的信号干扰,显著提升检测效果。同时,如果想寻找与目的蛋白结合的未知互作蛋白,通过质谱平台,金开瑞可以为您提供互作蛋白寻找鉴定服务。
技术流程
免疫共沉淀
3.2 GST融合蛋白沉降(GST pull down)
       蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见,最好通过免疫共沉淀(Co-IP)或Pull down技术研究。Pull down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-),从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。
        通过Pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系,从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。同时,如果您不清楚具体的互作蛋白,想寻找与目的蛋白结合的互作蛋白,通过质谱平台,金开瑞可以为您提供互作蛋白寻找鉴定服务。
技术流程
GST pull down
 
3.3 酵母双杂交(Y2H)
        酵母双杂交技术最初由Fields等人在研究酵母转录因子GAL4性质时建立,后续经过不断改进已发展成为一种成熟的蛋白-蛋白互作研究工具,具有简便、灵敏、可反映蛋白在活细胞内互作真实情况的特点,被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的鉴定/验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。
技术流程
酵母双杂交