该文章发表在Int J Nanomedicine期刊上题为《Hypericum Perforatum-Derived Exosomes-Like Nanovesicles: A Novel Natural Photosensitizer for Effective Tumor Photodynamic Therapy》。在天然来源的光敏剂中，贯叶连翘因其药用特性而被广泛研究。金丝桃素是贯叶连翘的主要生物活性化合物，作为光动力疗法（PDT）的光敏剂显示出强大的潜力；然而其临床应用受到溶解性差、亲脂性高、稳定性差和生产成本高的限制。为解决这些限制，该研究介绍了贯叶连翘来源的外泌体样纳米囊泡（HPDENs）作为 PDT 的新型光敏剂。研究结果突出了其增强的治疗效果和基于图像监测的附加能力，为癌症治疗提供了一个双功能平台。这些结果使 HPDENs 成为推进更有效和更具选择性的 PDT 方法的有前途的候选者。

一、研究价值

    HPDENs为天然光敏剂的临床应用提供了新思路，其制备工艺（尺寸排阻色谱+超速离心）可规模化，且成本低于合成纳米载体，具有较高的产业化前景。传统光敏剂（如卟啉类、氯素e6）存在水溶性差、肿瘤靶向性低等问题，而HPDENs通过植物外泌体的天然靶向性（如肿瘤高通透性和滞留效应）和纳米尺寸（67 nm）优化了药物递送效率。

    本研究首次揭示植物外泌体可作为光敏剂载体，并证实其光合成分（如类囊体膜蛋白）可能增强ROS生成，为其他植物源性纳米药物的开发提供了范例。证实食用菌纳米囊泡可通过"抗氧化-造血系统保护-器官损伤修复"多通路发挥辐射防护作用，为膳食来源纳米囊泡的跨物种调控机制提供新证据。开发新型天然辐射防护剂（相比化学防护剂Leucogen副作用更低），为功能性食品开发提供纳米载体新选择。

一、主要研究思路

1、贯叶连翘来源的外泌体样纳米囊泡（HPDENs）的特性

    通过尺寸排阻色谱（SEC）和超高速离心方法从天然植物贯叶连翘中获得外泌体样纳米囊泡。光照（510-670 nm LED 光，30 分钟）和未光照的 HPDENs 表现出双层杯盘结构（图 1A），平均粒径约为 67±3.13 nm（图 1B），zeta 电位为 - 16.4±0.28 mV（图 1C）。对光处理和非光处理的 HPDENs 进行了详尽的蛋白质组学分析。研究共获得 61 种差异表达蛋白，包括 25 种上调和下调蛋白。对 HPDENs 进行了 miRNA 测序分析（ 1D-F），结果表明在光照后 82 种 miRNA 表达差异，其中 11 种上调，71 种下调。HPDENs 在 598 nm 处表现出最大吸收（图 1D）。此外，荧光分光光度计显示 HPDENs 是自荧光的，并在极性溶剂如 PBS 中表现出荧光特性，表明这些外泌体有可能作为天然成像剂（图 1E 和 F）。将制备的 HPDENs 在 4°C 避光环境中储存 7 天进行稳定性测试。测量相对粒径分布（S/(S/S₀×100%) 图 1G）和紫外 - 可见吸收强度（A/(A/A₀×100%) 图 1H），在测试期间保持一致。然而，相对荧光强度（F/(F/F₀×100%)×100%）随时间略有下降（图 1I）。为了更深入地了解 HPDENs 的组成，采用了高效液相色谱（HPLC）分析（图 1J）。色谱结果显示 HPDENs 和金丝桃素的保留时间相同，为 HPDENs 中存在金丝桃素提供了令人信服的证据。通过外标法对 HPDENs 中的金丝桃素相对于金丝桃素标准品进行定量，得到比例为 1:97.05（1.03%）（图 1K）。这种细致的分析证实了金丝桃素在 HPDENs 中的封装，揭示了它们在靶向药物递送和成像方式中的潜在应用。

图1.HPDEN 的特征

2、HPDENs表现出光敏剂特性

    为了研究 HPDENs 作为天然光敏剂的潜力，使用 SOSG 评估单线态氧的产生，SOSG 是一种与单线态氧反应时发出绿色荧光的特异性探针。实验包括三组：PBS 作为对照组，金丝桃素（HYP）组作为阳性对照组，HPDENs 作为实验组，结果表明，随着光照时间的延长，HPDENs 的单线态氧产生显著增加，比 HYP 组高 69.98 倍。相比之下，在 PBS 和 HYP 组中检测到的单线态氧极少，表明 HPDENs 作为 II 型光敏剂起作用（图 2A）。随着光照时间的延长，HPDENs 的单线态氧产生显著增加。

    随后研究了光激活后超氧阴离子的生成。实验设计PBS、HYP 和 HPDENs 组，随着光照时间的增加，HYP 和 HPDENs 组的荧光强度都有所上升（图 2B）。使用羟苯基荧光素（HPF）作为探针对羟基自由基的生成进行了研究。结果显示，随着光照时间的增加，HPDENs 和 HYP 组产生了高细胞毒性的羟基自由基，HPDENs 组的羟基自由基产生量比 HYP 组高 2.75 倍（图 2C）。最后，使用探针 DCFH-DA 探索了总 ROS 的产生。研究结果表明，随着光照时间的增加，HYP 和 HPDENs 组都产生活性氧。光照 20 分钟后，HPDENs 组的总 ROS 产生量比 HYP 组高 1.18 倍（图 2D）。实验结果表明，HPDENs 表现出 I 型和 II 型光敏剂的特性（图 2E）。

图2.HPDEN 具有光敏特性

3、HPDENs对肿瘤细胞的光动力作用

    我们继续研究了光动力 HPDENs 对人黑素瘤细胞 WM-266-4 细胞的体外抑制作用。发现共培养后细胞成功摄取了 HPDENs，在细胞内建立了重要的治疗时间框架（图 3A 和 B）。我们检查了光动力 HPDENs 对细胞活力的影响。外泌体与细胞共培养 12小时后，我们使用 590 nm、4 mW/cm² 的 LED 光以不同的能量强度照射细胞（图 3C）。光照后细胞存活率呈光剂量/浓度依赖性下降（IC₅₀=6.669 μg/mL）（图 3D-F）。

    我们开始分析 WM-266-4 细胞的 ROS 产生和凋亡情况，结果显示，非光照和光照的 PBS 组中 ROS 水平没有显著增加。然而，光照处理的 HYP 组和 HPDENs 组的 ROS 水平显著升高（图 3G）。值得注意的是，HPDENs 组的荧光强度比 HYP 组高 1.42 倍，这与之前 HPDENs 组总 ROS 比 HYP 组高 1.36 倍的发现一致（图 3H）。在此之后，我们研究了光动力治疗后 HPDENs 对黑素瘤细胞凋亡的影响。流式细胞术结果表明，光动力治疗后，HYP 组和 HPDENs 组的 Annexin V 表达显著增加，突显了细胞凋亡的明显诱导。相比之下，PBS 组没有观察到变化（图 3I 和 J）。蛋白质免疫印迹结果显示，与其他组相比，HPDENs + 光照组的 WM-266-4 细胞中 Caspase 3 和 Bax 的表达显著增加（图 3K 和 L）。这些发现证实，HPDENs 与光动力治疗的结合导致肿瘤细胞内 ROS 水平大幅升高，从而诱导细胞凋亡。

图3. HPDEN 对肿瘤细胞的光动力学影响

4、HPDENs的体内光动力治疗

    为了阐明 HPDENs 的体内抗肿瘤潜力，我们在裸鼠中建立了初始体积约为 100 mm³ 的肿瘤。然后将小鼠静脉注射 PBS、HYP（0.25 mg/kg）和 HPDENs（1 mg/kg），随后分为光照和非光照治疗组进行光动力治疗。光动力治疗 15 天后，在光照处理的 HYP 和 HPDENs 组中观察到可见的肿瘤坏死，而在非光照处理和光照处理的 PBS 组中没有观察到显著变化（图 4A）。在 15 天的时间里，体重保持稳定（图 4B）。值得注意的是，光照处理的 HYP 和 HPDENs 组的肿瘤组织生长明显受到抑制，与非光照处理组和光照处理的 PBS 组相比，体积显著更小（图 4C 和 D）。HE 染色显示，未照射和照射的 PBS 组几乎没有坏死，肿瘤细胞呈巢状排列。相比之下，照射的 HYP 和 HPDENs 组表现出明显的坏死区域（图 4E）。TUNEL 染色显示，光照处理的 HYP 和 HPDENs 组的凋亡肿瘤细胞增加，而未照射和 PBS 组的凋亡肿瘤细胞较少（图 4F 和 G）。这些发现突出了 HPDENs 在体内强大的抗肿瘤功效。

图4.HPDEN 体内 PDT 的抗肿瘤作用

5、HPDENs的生物相容性

    为了评估 HPDENs 在体内光动力治疗后的生物相容性，我们对注射 PBS 和 HPDENs 的裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行了苏木精 - 伊红（HE）染色和切片。结果显示，注射 PBS 或 HPDENs 的小鼠的主要器官没有明显损伤（图 5A）。随后进行血清分析以评估肝肾功能，结果显示 HPDENs 组和 PBS 组之间没有显著差异，所有肝肾功能生物标志物均在正常范围内（图 5B）。这些发现表明，向裸鼠注射 HPDENs 不会导致可观察到的器官损伤或肝肾毒性，从而表明 HPDENs 具有良好的生物相容性。能够减轻辐射对小鼠机体的损伤，延长小鼠的生存时间。

图5. HPDEN 的生物相容性

    我们提出了一种多功能的新型植物来源光敏剂，即源自贯叶连翘的 HPDENs，其具有光动力特性和荧光成像能力。HPDENs 表现出 I 型和 II 型双重光敏剂特性，能强有力地产生活性氧（ROS），在体外显著降低黑素瘤细胞活力并促进细胞凋亡增加。体内研究进一步证明了 HPDENs 在靶向和抑制肿瘤生长方面的功效，且不会诱导器官毒性（图 6）。这些发现值得进一步探索 HPDENs 在靶向药物递送和光动力治疗方式中的潜在应用。

图6. 肿瘤 PDT 过程中 HPDEN 的示意图

    本研究提出贯叶连翘来源的外泌体样纳米囊泡（HPDENs）作为光动力疗法（PDT）的新型光敏剂，其显示出增强的活性氧（ROS）产生，并解决了游离金丝桃素的关键限制，如溶解性差、生物利用度低和肿瘤选择性不佳等问题。与传统的基于金丝桃素的疗法相比，HPDENs 具有更高的稳定性、靶向递送能力和生物相容性。然而，进一步研究它们与肿瘤微环境（包括免疫细胞和基质细胞）的相互作用至关重要，以充分阐明其作用机制并优化其在 PDT 中的临床适用性。

文献：Ma X, Chen N, Zeng P, He Y, Zhang T, Lu Y, Li Z, Xu J, You J, Zheng Y, Wang L, Luo M, Wu J. Hypericum Perforatum-Derived Exosomes-Like Nanovesicles: A Novel Natural Photosensitizer for Effective Tumor Photodynamic Therapy. Int J Nanomedicine. 2025 Feb 4;20:1529-1541.