蛋白互作研究利器：Co-IP实验的核心要点

    免疫共沉淀技术（co-Immunoprecipitation,Co-IP）是一种研究两种蛋白在体内是否存在相互作用的有效方法。

一、实验原理

    免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（Protein A/G）偶联的agarose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

图1.CO-IP实验原理

 

二、IP、Co-IP、ChIP和RIP的区别

    不同类型的分子互作（如蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA）具有高度特异性，仅凭单一技术难以全面解析。IP（免疫沉淀）、Co-IP（共免疫沉淀）、ChIP（染色质免疫沉淀）和RIP（RNA免疫沉淀） 作为分子互作研究的四大基石技术，分别针对不同维度的相互作用设计。若混淆其应用场景，轻则导致实验失败，重则产生误导性结论——例如，用IP验证蛋白互作可能遗漏关键结合伙伴，而误用ChIP研究RNA结合蛋白则会完全偏离目标。因此，精准区分四者的原理与适用范围，不仅是实验设计的首要前提，更是确保数据可靠性和科学价值的关键。

实验类型	原理	主要应用	关键区别
IP (Immunoprecipitation)	是利用抗原抗体特异性反应纯化富集样品中目的蛋白。	-鉴定特定蛋白的存在和表达水平， 检测蛋白翻译后修饰（如磷酸化、泛素化）； 确定蛋白复合物形成。	侧重于蛋白符合物研究；适用于蛋白纯化或修饰研究。
Co-IP (Co-Immunoprecipitation)	在IP基础上捕获与靶蛋白直接/间接结合的互作蛋白，验证蛋白复合物。	验证蛋白质相互作用； 研究信号通路复合物； 药物靶点筛选。	需验证互作蛋白，需设置阴性对照（如IgG）；适用于生理条件下的蛋白互作验证。
ChIP (Chromatin Immunoprecipitation)	甲醛交联固定DNA-蛋白复合物，超声打断染色质后，用抗体富集靶蛋白结合的DNA片段。	鉴定转录因子结合位点； 分析组蛋白修饰；  表观遗传调控机制研究。	检测DNA与蛋白结合，需交联和DNA纯化；适用于基因调控研究。
RIP (RNA Immunoprecipitation)	利用抗体捕获RNA结合蛋白（RBP），分离与其结合的RNA分子。	分析RNA结合蛋白功能；非编码RNA功能机制研究。	检测RNA与蛋白结合，需抑制RNase活性；适用于RNA功能或调控网络分析。

 

三、Co-IP实验流程简介

1. 样品制备

    裂解细胞/组织：使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（建议冰上操作）。

    离心去除碎片：12,000×g离心10分钟，取上清作为总蛋白样品。

    ★注意：蛋白提取整个过程都在冰上操作，减少高温造成的蛋白降解；超声过程中最好不要有气泡产生，减少蛋白降解。裂解后的总蛋白放在-20℃保存。

2. 抗体-磁珠孵育

    预清洗磁珠：用裂解液洗涤Protein A/G磁珠，去除保存液。

    抗体结合：加入靶蛋白抗体，4℃旋转孵育1-2小时（或过夜）。   

    ★注意：抗体选择经过IP验证的，可减少假阳性概率。同时要注意抗体/缓冲液的比例，抗体稀释过度不利于后续抗原抗体结合；而抗体过多就不能完全沉降在固相基质上，残存于上清。

3. 抗原捕获

    加入总蛋白样品：与抗体-磁珠复合物4℃旋转孵育4小时。

    阴性对照：平行设置同型IgG抗体对照组。

4. 洗涤与洗脱

    洗涤步骤：用预冷裂解液洗涤3-4次，去除非特异性结合。

    蛋白洗脱：加入SDS上样缓冲液，95℃加热10分钟，离心取上清。

5. 结果检测

    Western Blot：用目标蛋白B的抗体检测洗脱样品。

    数据分析：对比实验组与对照组的条带差异，验证相互作用。

    ★注意：增加在洗脱之前的洗涤次数或在免疫共沉淀缓冲液中加入 Triton X-100 ，可以降低非特异性结合，以防止蛋白在阴性对照树脂实验样品中被检测到。

 

四、Co-IP实验注意事项

1.抗体选择

    使用已验证特异性的抗体，避免交叉反应。

实验组与检测抗体避免使用同一物种来源（防止二抗干扰）。

2.裂解条件优化

    裂解液成分：NP-40浓度建议0.1%-1%，过高会破坏天然复合物。

避免反复冻融样品，防止蛋白降解。

3.对照设置

    必须包含：阴性对照（IgG）、阳性对照（已知互作蛋白）、Input对照。

4.操作细节

    全程低温操作（冰盒或冷室）。

    洗涤时轻柔吹打，避免磁珠损失。

    离心转速不超过3000×g，防止复合物解离。

5.结果解读

    需排除假阳性：如蛋白间非特异性结合或抗体交叉反应。

    建议结合GST pull-down等互补实验验证。

 

五、结果解读

 

图2. IP前WB质控（CoIP、ChIP和RIP都需要进行WB）

    ❖在正式实验前，务必要对样品做WB质控；

    ❖IP前WB检测的指标应至少包括诱饵蛋白以及内参蛋白，如果有预期的猎物蛋白，也应在IP前检测本底表达水平；

    ❖内参蛋白条带必须清晰无拖带，如果内参条带不正常，说明样本内蛋白已经发生降解，需要重新备样；

    ❖诱饵或猎物蛋白条带最好是强信号的单带，如果信号比较弱，IP后可能检测不到信号，导致实验失败，或误判成假阴性结果，建议在样本中过表达目的蛋白后再做尝试；

    ❖诱饵蛋白WB如果杂带较多，可能是该批次抗体在该样本中的特异性不够好，如果实在没有合适的抗体，也至少应当在目的条带的信号相较于杂带足够强的前提下，再进行后续实验，否则无法保证最终结果的可靠性。

图3. IP后WB

    1.一次完整严谨的CoIP实验，应当包含IgG对照组、IP实验组以及Input组；

    2. Input泳道所点样本与IP前WB一致，作为阳性对照；

    3. 判定CoIP实验成功的标准，是能够在IP泳道检测到诱饵蛋白信号，且IgG泳道检测不到；如果IgG泳道也检测到诱饵蛋白，说明该蛋白能够与所有IgG类的抗体结合，只能换别的实验如酵母杂交、GST pulldown等来验证。

    4.在IP后能够检测到诱饵蛋白的前提下，如果检测不到猎物蛋白，说明两个蛋白不互作，至少在这个样本和实验体系下不互作，并不代表实验本身有问题；

    5.CoIP后往往会在IgG和IP泳道出现目的条带以外的杂带，这是由于CoIP实验会往实验体系中加入抗体进行富集，这些抗体最终也会也会被WB的二抗识别到；

    6.抗体由轻链和重链构成，轻链分子量约为25KD，重链分子量约为50-70KD，如图3所示，由于使用了识别轻链的二抗，因此IgG和IP泳道均在25KD左右出现了抗体链条带；

    7.在做IP后WB时，为了避免抗体链对结果的干扰，应灵活选择二抗，如左图所示，由于目的条带在重链范围，因此选择了识别轻链的二抗。

 

六、常见问题与解决方案

 

Q：IgG组及IP组均检测到目的条带，为什么？

A：Co-IP WB鉴定结果IgG组无目的蛋白条带、IP组有目的蛋白条带，说明IP过程成功，此时质谱极低概率会在IgG组中鉴定到目的条带，如果遇到这种情况可能是在切胶及质谱样品处理过程中发生了串染，对IP组中互作蛋白的结论没有影响，IgG组中的蛋白在文章中通常都不是考察对象。

Q：IP后WB鉴定到目的蛋白，质谱未鉴定到，为什么？

A：IP后WB检测到目的蛋白条带，说明IP过程成功。我们从自身技术流程步骤做排查，确保相关质控均合格，通过标准品检测质谱当时的状态正常，保证技术流程及质谱性能均无问题。如果确实质谱未发现目的蛋白，通常是由于蛋白本身在样品中相对丰度较低导致，由于质谱过程中其他相对高丰度的蛋白可能掩盖部分信号、导致样品中低丰度蛋白未被鉴定。

Q：Co-IP实验成功的评判标准?

A：在 Co-IP-WB鉴定结果中，IgG组无目的蛋白条带、IP组有目的蛋白条带，说明IP过程成功；银染胶图中，IP组相对于IgG组有更多蛋白条带、且存在差异，说明 Co-IP过程捕获到互作蛋白；IP产物在质谱检测中鉴定到的蛋白数量不能作为判断实验成败的标准，因为这取决于目的蛋白本身所具有的互作蛋白数量、结合力强弱等方面；IP产物的质谱鉴定数量越多并不代表结果越好。

Q：Co-IP需要准备多于多少样本量？

A：是的。Co-IP实验需要保证足够的蛋白浓度才能维持原本存在的蛋白互作状态，尤其当蛋白丰度较低、相互作用力不强、使用不易提蛋白组织等情况时。而且 Co-IP的实验条件往往需要反复摸索。因此用于 Co-IP实验需准备细胞＞2x10⁷，动物组织＞500mg，植物组织＞2g，并且须更加注意采集后速冻-80℃保存和避免反复冻融。

Q：Co-IP实验成败的主要因素？

A：a.所使用的抗体不仅需要优秀的亲和力、特异性，其识别表位还可能被互作蛋白所掩蔽（主要是使用单抗时）；
b.当蛋白互作须发生在特定生理代谢条件、组织细胞类型之中时， Co-IP实验可能无法获得互作结果；
c.如果诱饵蛋白和或捕获蛋白在样本中丰度很低时；
d.两个互作蛋白的亲和力较弱；
e.当该蛋白互作需要较特定的离子强度，或者需要如Ca离子/Mg离子/ATP等辅因子时，要创造合适的反应条件会变得困难；
f.一些样品处理提取存在难度，提取足量目的蛋白与保持蛋白天然状态，需通过实验条件达到优化平衡；
g.外源表达的标签蛋白存在同内源蛋白的位点竞争，这主要在使用标签抗体进行实验时可能存在。