想测结合常数，但样本太珍贵？来试试MST技术

    微量热泳动技术（MicroScale Thermophoresis, MST）是一种表征生物分子特性的光学方法，是粒子在微观温度梯度中的定向运动。生物分子的质量、电荷、水化层和构象发生改变均可导致分子在温度梯度场中运动速度的变化，这种变化可以用来分析分子间相互作用以及各种化学剂量学参数。将波长为1480 nm 的红外激光照射于荧光激发光路上，通过分色镜照射到毛细管中的样品，样品中的水分子吸收红外光发热而形成温度梯度。MST 仪器通过记录激光器打开前、打开期间和打开后处于温度梯度中的样品内部红外激光照射区域的荧光变化情况，从而实现较短时间的测定。

    在典型的MST实验中，每个样品的体积通常为10-20 μL，且无需大量纯化的生物分子，甚至可以直接使用细胞裂解液、血清等复杂样品进行检测。这种低样本量需求的特点使得MST技术特别适用于珍贵、稀有或难以大量制备的样品，如膜蛋白、从临床样本中提取的生物分子等。

一、技术热度

    根据PubMed数据库的统计，截至2025年，已有1473篇研究论文运用了MST技术，这一数据不仅体现了该技术在分子互作研究领域的稳定增长，也反映出其正被越来越多研究者所采纳并应用于多样化的科学问题中。近年来，随着该技术在灵敏度、样品通量和适用性方面的持续优化，其相关出版物数量呈现显著上升趋势，尤其在蛋白质-小分子、蛋白质-核酸以及膜蛋白相互作用等研究方向上成为关键工具之一。

二、优点

1. 检测下限低，弱分子力首选；

2. 样本量小，且样品无需固定；

3. 能够测量复杂混合物（即细胞裂解物、血清、洗涤剂、脂质体）；

4. 相互作用物尺寸范围广（离子到MDa复合物），即使是小分子量的离子与大型蛋白质或超大蛋白复合物之间的结合，也能实现高灵敏度检测。

 

三、适用范围

❖蛋白质-蛋白质（包括抗原-抗体、分子伴侣-底物）；

❖蛋白质-核酸、核酸-核酸；

❖蛋白-小分子（蛋白酶与抑制剂、细胞膜蛋白活性）；

❖蛋白-肽、肽-肽等相互作用；

    比ITC能检测更微小的相互作用，可检测任意两种小分子之间的亲和力，其中一个需要有氨基（所有的蛋白都有），带氨基的要纯度高，另一个没有要求。

 

案例1：免疫检查点抑制剂结肠炎的治疗新策略

    主要研究内容：研究阐明了长型肌球蛋白轻链激酶1（MLCK1）在免疫检查点抑制剂（ICIs）诱发结肠炎中的关键作用，并发现小分子化合物表儿茶素可通过阻断MLCK1与FKBP8的相互作用，减轻结肠炎而不影响抗肿瘤免疫。

    MST实验目的：用于验证MLCK1与FKBP8的直接结合，并评估表儿茶素对该结合的抑制效果。

    MST具体做法：使用标记后的MLCK1蛋白与FKBP8进行结合实验，再分别加入表儿茶素，通过MST检测结合曲线的变化。

    MST实验结果：通过表面等离子共振（SPR）与微量热泳动（MST）技术，我们确认了MLCK1能够直接结合FKBP8（图D，F）。在确立这一结合关系的基础上，我们利用SPR实验证明，表儿茶素可竞争性抑制FKBP8与MLCK1之间的相互作用（图E）。尽管表儿茶素未能完全阻断该相互作用，但在MST实验中它显著降低了二者的结合亲和力，其解离常数（Kd值）从1.78 µM上升至15.3 µM（图F，G）。

 

案例2：烟草与真菌互作机制研究

 

    该研究揭示了烟草通过钙结合蛋白NtCML19识别立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）分泌的去乙酰化酶RsDN3377，从而激活植物免疫反应、抑制真菌侵染的分子机制。

    MST实验目的：用于验证NtCML19是否具有钙离子结合活性，明确其作为钙传感器的功能基础。

    MST具体做法：将10mM /L的NtCML19-His蛋白溶液与NHS/NT-647染料按1:5摩尔比混合，于22°C避光孵育30分钟。未结合染料通过含吐温的磷酸盐缓冲液进行缓冲液置换去除。结合亲和力测定时，将1毫摩尔/升CaCl₂用HEPES缓冲液（20毫摩尔/升HEPES、150毫摩尔/升KCl，pH 7.4）进行梯度稀释，并与标记蛋白溶液混合。混合液注入毛细管后，使用Monolith NT.115仪器分析相互作用，最终基于热泳信号与温度跃变数据计算解离常数

    MST实验结果：MST结合曲线显示NtCML19与钙离子具有特异性结合，解离常数（Kd）为2.25 ± 0.18 μM，证实其作为钙结合蛋白的功能特性。

 

案例3：AQP5新型功能调控因子CLIP2的鉴定、互作验证与功能解析

 

    主要研究内容：本研究旨在探究AQP5（水通道蛋白 5）在舍格伦综合征（SjD）中失调的分子机制，并鉴定其新的互作蛋白。通过蛋白质免疫共沉淀、质谱分析、计算建模、基因编辑与功能实验等方法，首次发现并验证了 CLIP2 是 AQP5 的新型互作蛋白，其在调控 AQP5 向细胞膜运输中起关键作用，且该互作在 SjD 患者中异常，可能成为新的治疗靶点或生物标志物。

    MST 实验目的：用于定量验证AQP5 与 CLIP2 的直接相互作用，并测定其结合亲和力（Kd 值）。通过使用重组表达的 AQP5 和 CLIP2 蛋白，MST 实验确认了二者之间的特异性结合，为后续功能实验提供了直接的结合证据。

    MST 具体做法：

    ◆蛋白准备：使用重组表达的全长AQP5 蛋白以及 CLIP2 的两个 MTB 结构域（MTB1 和 MTB2）。

    ◆标记与检测：将CLIP2 蛋白用荧光染料 Alexa 488 标记，与不同浓度的 AQP5 蛋白混合。

    ◆实验条件：在MST 缓冲液中进行结合反应，使用 Monolith NT.115 仪器检测荧光变化，计算结合曲线。

    ◆对照实验：还测试了单独的MTB 结构域是否能够与 AQP5 结合，以验证完整结构域的必要性。

    MST 实验结果：CLIP2（两个 MTB 结构域）与 AQP5 的结合 Kd 值为 106 ± 17.7 nM，表明二者具有较高的亲和力。单独的 MTB1 或 MTB2 结构域均未检测到与 AQP5 的结合，说明完整的 MTB 结构域是互作所必需的。AQP5 C 末端肽段与 CLIP2 的结合 Kd 值为 467 ± 248 nM，进一步确认互作由 AQP5 C 末端介导，与已报道的 AQP5 互作机制一致。

图注：AQP5与CLIP2在分子水平的相互作用。A： MST实验的结合曲线显示了AQP5与CLIP2之间的直接相互作用。数据以结合分数的平均值±标准差表示（n=3）。曲线代表对单一位点结合模型的曲线拟合。B：针对CLIP2各MTB结构域（MTB1与MTB2）的MST数据显示，它们与AQP5之间不存在相互作用。

 

    MST作为一种无需固定、样品消耗少、可检测复杂体系的相互作用分析技术，在上述案例中均发挥了关键作用。其高灵敏度、广泛适用性和接近生理条件的检测环境，使其成为机制研究、药物筛选与诊断工具开发中的重要工具。

    金开瑞生物分子互作检测平台致力于为生命科学研究和药物开发提供全面、精准的分子相互作用分析服务。平台整合了多项国际先进的检测技术，可依据客户具体需求，提供包括MST（微量热泳动）、SPR（表面等离子共振）、BLI（生物膜层干涉）及ITC（等温滴定量热法） 等在内的多种互作检测方案。

 

➤MST技术：

    能够在接近天然溶液条件下，快速、灵敏地检测分子结合过程中的热力学变化，适用于小分子、蛋白质、核酸等各类生物分子的亲和力测定。

 

➤SPR技术：

    可实时、无标记监测分子间相互作用的动力学过程，获取结合常数、解离常数及亲和力数据，广泛应用于抗体筛选、受体-配体研究等领域。

 

➤BLI技术：

    基于光学干涉原理，实现实时、高通量的分子互作分析，特别适用于快速筛选与初步亲和力评估。

 

➤ITC技术：

    则直接测量结合过程中释放或吸收的热量，一次实验即可同时获取亲和力、化学计量比及热力学参数，是深入机理研究的理想手段。

 

    平台配备专业仪器与经验丰富的技术团队，从实验设计、样品检测到数据分析，为客户提供一站式的分子互作研究支持，助力药物发现、靶点验证、抗体优化及信号通路机制探索等多项科研与开发需求。

 

参考文献：

[1]Xiong L, Huang J, Dong Y, et al. Targeting MLCK1 uncouples immune checkpoint inhibitor-induced colitis from antitumour immunity. Gut. 2026 Jan 6:gutjnl-2025-337780.

[2]Li X, Li Y, Liu H, An M, Xia Z, Zhang C, Chen W, Wu Y. NtCML19 Is Recruited by Tobacco to Interact With the Deacetylase Protein RsDN3377 of Rhizoctonia solani AG3-TB, Inhibiting Fungal Infection. Mol Plant Pathol. 2025 Nov;26(11):e70181.

[3]Martin DR, Waddad A, Gafar MA, Govender T, Cloete R, Madiehe AM, Meyer M. Integrating Magnetic Bead-Based SELEX with In Silico Binding Analyses for the Identification of High-Affinity DNA Aptamers Targeting TAGLN2. ACS Omega. 2025 Nov 18;10(47):57067-57084.