双荧光素酶实验，如何助力客户连发IF>10高分文章？揭秘我们的核心技术与成功案例！

    双荧光素酶报告基因实验（Dual-Luciferase Reporter Assay）是研究基因转录调控、信号通路激活以及非编码RNA靶向验证的关键分子生物学技术。该体系基于萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）两种报告基因，通过共转染至细胞中，分别检测目标启动子或3′UTR的转录活性或靶向调控效应。萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，反映目标序列的调控活性；海肾荧光素酶作为内参，校正转染效率与细胞活性差异，确保结果的可靠性与重复性。

    该技术具有灵敏度高、线性范围宽、操作便捷、适用性广等优势，已成为研究转录因子与DNA互作、miRNA与靶基因结合、信号通路调控等领域的“金标准”实验手段。

 

一、主要应用方向

1、验证miRNA与靶基因结合

    将靶基因序列构建到萤⽕⾍荧光素酶基因3’区域，同时过表达microRNA。当microRNA与靶基因上特异结合位点结合后，将⼲扰荧光素酶mRNA的翻译或导致其迅速降解，使荧光强度降低；当结合位点被突变后，microRNA⽆法与靶基因结合，因此荧光值⽆明显变化。

 

2、验证转录因子与启动子结合

    将启动⼦序列构建到萤⽕⾍荧光素酶基因前，同时过表达转录因⼦。当转录因⼦与启动⼦上特异结合位点结合后激活荧光素酶基因转录，使萤⽕⾍荧光素酶得以表达，最终荧光强度上升；当结合位点被突变后，转录因⼦⽆法与启动⼦结合，因此荧光值⽆明显变化。

    以下为金开瑞与多家科研团队合作发表的高水平研究中，双荧光素酶实验在解析分子机制中的关键应用案例。

 

案例1：验证肿瘤来源miRNA 对肌肉萎缩相关基因的靶向调控

2025年7月

期刊：Advanced Science (IF=14.1)

研究题目：Pancreatic Cancer-Derived Extracellular Vesicles Enriched with miR-223-5p Promote Skeletal Muscle Wasting Associated with Cachexia

研究背景：胰腺癌来源的胞外囊泡（EVs）可通过递送 miR-223-5p 促进肌肉萎缩，但其直接靶基因及调控方式尚不明确。

双荧光素酶实验设计：

为验证miR-223-5p 是否直接靶向 MAFA 基因的 3′UTR，研究构建了两种报告基因载体：一种携带 MAFA 3′UTR 的野生型序列，另一种则在预测的 miR-223-5p 结合位点引入突变。将报告基因载体分别与 miR-223-5p 模拟物（mimics）或对照共转染 C2C12 成肌细胞。

关键结果：

过表达miR-223-5p 可显著抑制野生型 MAFA 3′UTR 的报告基因活性，突变miR-223-5p 的结合位点后，其抑制效应完全消除。

科学意义：

该结果在分子水平直接证实了miR-223-5p 通过结合 MAFA  mRNA 的 3′UTR 抑制其表达，阐明了胰管腺癌（PDAC）来源EVs 通过 miRNA 调控肌肉基因表达、导致萎缩的精确路径，为开发靶向治疗策略提供了新靶点。

 

案例2：阐明缺血性卒中神经元损伤的miRNA调控网络

 

 

发表时间：年7月

期刊：Journal of Advanced Research（IF：13.0）

研究题目：Endothelial cells secrete small extracellular vesicles to promote neuron endoplasmic reticulum stress injury via miR-146a-5p/Eif4g2 axis in ischemic stroke

研究背景：

内皮细胞来源的小细胞外囊泡通过传递miR-146a-5p促进神经元内质网应激损伤，但其直接靶基因及作用机制不明。

双荧光素酶实验设计：

为验证miR-146a-5p是否直接靶向Eif4g2的3'UTR，研究者构建了：野生型Eif4g2 3'UTR报告载体；突变型Eif4g2 3'UTR报告载体（突变miR-146a-5p结合位点）

实验结果：

miR-146a-5p模拟物显著抑制野生型Eif4g2 3'UTR的荧光素酶活性，突变结合位点后，miR-146a-5p的抑制效应消失，该结果在体内外模型中得到一致验证。

 

科学意义：

该实验证实Eif4g2是miR-146a-5p的直接靶基因，揭示了内皮细胞-神经元通过miRNA-靶轴调控内质网应激的新机制，为卒中治疗提供了新靶点。

 

案例3：揭示环境毒物诱导神经毒性的转录调控机制

 

发表时间：2024年9月

期刊：Journal of Hazardous Materials (IF=12.2)

研究题目：Targeting m⁶A mRNA demethylase FTO alleviates manganese-induced cognitive memory deficits in mice

研究背景：锰（Mn）暴露可导致学习记忆损伤，但其表观遗传调控机制不明。研究发现，Mn 通过影响转录因子 SOX2 的磷酸化，下调去甲基化酶 FTO 的表达，进而影响突触可塑性相关基因的 m⁶A 修饰与稳定性。

双荧光素酶实验设计：

为了探索Mn如何下调海马中FTO表达的机制，我们使用人和小鼠的JASPAR 、TFDB和GTRD 数据库来选择潜在的转录因子，确定了四种转录因子，SOX 2、GABPA、STAT 3和RUNX 1作为候选物，我们将FTO启动子克隆到编码荧光素酶的pGL 3基本载体中，然后将构建体与转录因子质粒和pRL-TK质粒一起转染到HEK 293 T细胞中，随后进行荧光素酶报告基因测定。

关键结果：

只有SOX2 可显著激活 FTO 全长启动子的报告基因活性，截短实验锁定其核心结合区域位于启动子−700bp 至−400 bp 区间。点突变该区域内预测的 SOX2 结合序列（“aaacaatagac” → “gggtgccgagt”）后，相对荧光素酶活性明显降低。

图注：（E-H）SOX 2、STAT 3、GABPA、RUNX 1和FTO双荧光素酶报告定量结果；（I，J）将携带不同截短的纤连蛋白（F-N）启动子的pGL 3-basic载体与pRL-TK共转染入HEK 293 T细胞中。

 

科学意义：

该实验直接证明了SOX2 作为转录因子直接结合并激活 FTO 启动子，明确了 Mn 通过抑制 SOX2 磷酸化进而下调 FTO 表达的转录层面机制，为理解 Mn 神经毒性的上游调控提供了关键证据。

 

案例4：揭示膀胱癌化疗耐药新机制

 

发表时间：2025年7月

期刊：Research (IF=10.7)

研究题目：Combinational Analysis of Metabolomic and O-GlcNAcylation Omics Reveals the HBP Metabolic Regulation of Chemoresistance via GFPT1/NR3C1 O-GlcNAcylation/GPX4 Axis

研究背景：

膀胱癌化疗耐药是临床治疗难点，研究发现NR3C1通过O-GlcNAc修饰增强其转录活性，进而调控下游基因GPX4表达，抑制铁死亡，促进耐药。

双荧光素酶实验设计：

为验证NR3C1是否直接结合GPX4启动子并调控其转录，研究者构建了：野生型GPX4启动子报告载体,突变型GPX4启动子报告载体（突变NR3C1结合位点“GAGACCAGCCTGACCAAC”）

实验结果：

NR3C1过表达显著增强野生型GPX4启动子的荧光素酶活性，突变NR3C1结合位点后，荧光素酶活性显著降低，O-GlcNAcylation位点的突变显著减弱了NR3C1介导的GPX4转录激活。

图注：(E) NR3C1在GPX4启动子上的结合序列示意图。(F) 双荧光素酶报告基因检测分析NR3C1在GPX4启动子上的结合位点特异性；检测T299A突变对荧光素酶活性的影响；以GPX4-LUC-WT + Vector组的荧光素酶活性水平为基准进行标准化；采用单因素方差分析及T检验进行统计分析（每组n=4）

 

科学意义：

该实验直接证实NR3C1通过特异性结合GPX4启动子增强其转录，揭示了O-GlcNAcylation修饰通过增强转录因子活性促进化疗耐药的分子机制。

 

案例5：揭示心脏移植后心肌缺血再灌注损伤新机制

 

发表时间：年9月

期刊：Advanced Science（IF：14.1）

研究题目：Inhibition of Macrophage ARID3A Alleviates Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury After Heart Transplantation by Reducing THBS1/CD47 Signaling-Mediated Neutrophil Extracellular Traps Formation

研究背景：

心脏移植后，M1型巨噬细胞中ARID3A转录因子上调，可能通过激活THBS1基因表达，进而促进中性粒细胞NETs形成，加重心肌损伤。需验证ARID3A对THBS1的直接转录调控作用。

双荧光素酶实验设计：

预测与设计：通过JASPAR数据库预测ARID3A在THBS1启动子上的两个潜在结合位点（P1， P2），并据此构建：野生型（WT）THBS1启动子荧光素酶报告载体。单位点（Mut P1， Mut P2）及双位点（Mut P1&P2）突变型报告载体。

功能验证：将上述报告载体与ARID3A过表达载体共转染293T细胞，检测荧光素酶活性变化。

关键结果：

ARID3A过表达可显著激活野生型THBS1启动子。

仅当P2位点突变时，ARID3A的激活作用完全丧失，证明P2是ARID3A的功能性结合位点。

ChIP实验进一步证实ARID3A蛋白直接结合于THBS1启动子的P2区域。

双荧光素酶报告器检测THBS1启动子活性。

 

 

科学意义：

该实验直接证实ARID3A通过特异性结合THBS1启动子的P2位点正向调控其转录，从而确立了ARID3A-THBS1轴在驱动巨噬细胞介导心肌损伤中的核心分子机制，为靶向干预提供了关键依据。