表观遗传学”新宠“ - CUT&Tag技术

一、核心原理

    CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是一种通过抗体引导转座酶靶向切割DNA的表观遗传学技术，其核心原理可类比为“分子导航+分子剪刀”：

    抗体定位：特异性抗体如同“GPS”，在细胞内精准识别目标蛋白。

    转座酶切割：蛋白A/G-Tn5融合酶结合抗体后，激活的Tn5转座酶在目标位点附近同时完成DNA双链切割和测序接头插入，产生约300-500bp的靶向片段。

    无需交联：全程在完整细胞或细胞核内操作，避免传统ChIP-seq中甲醛交联导致的空间结构破坏，显著降低背景噪声。

 

二、技术对比

    在众多技术中，染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq) 长久以来是研究特定蛋白质（如转录因子、修饰组蛋白）与基因组DNA相互作用的金标准。然而，其繁琐的流程、较高的细胞起始量要求以及对交联效率的依赖，促使了更高效替代方案的出现。CUT&Tag 正是在此背景下发展起来的革新方法，它利用抗体引导的蛋白A-Tn5转座酶在目标蛋白附近进行原位切割和标签插入，显著提高了信噪比、降低了所需细胞量并简化了操作流程，成为研究蛋白-DNA互作的新锐力量。与此同时，转座酶可及染色质测序 (ATAC-seq) 则开辟了另一条重要途径，它利用改造的Tn5转座酶直接标记并测序开放的、无核小体占据的染色质区域，从而高灵敏度地描绘全基因组的染色质可及性图谱，反映调控元件的活跃状态。接下来我们来看下三种技术的对比：

01.技术优势对比

技术	CHIP-seq	CUT&Tag	ATAC-seq
原理	通过抗体捕获目标蛋白-DNA复合物，然后进行高通量测序。	通过抗体引导的Tn5转座酶切割目标蛋白结合的DNA，并进行高通量测序。	利用Tn5转座酶切割开放染色质区域，并进行高通量测序。
样本需求	通常需要数百万细胞。	样本需求量少，可低至1,000-10,000个细胞。	样本需求量少，可低至50,000个细胞。
抗体需求	需要高质量的特异性抗体。	需要特异性抗体。	不需要抗体。
信噪比	信噪比可能较低，背景信号较高。	信噪比高，背景信号低。	信噪比高，背景信号低。
优势	技术成熟，适用于高丰度蛋白质-DNA相互作用研究。	样本需求量少，信噪比高，适用于低丰度蛋白或微量样本研究。	样本需求量少，成本低，适用于染色质开放性研究。
应用场景	研究特定蛋白质（如转录因子、组蛋白修饰）在基因组上的结合位点。	研究低丰度转录因子或组蛋白修饰，适用于微量样本或单细胞研究。	研究全基因组范围内的染色质开放区域，识别潜在的调控元件（如增强子、启动子）。

 

02.实验流程对比

 

三、CUT&Tag实验流程

（1）样本（细胞、动物组织和植物组织）前处理，不同样本前处理方法有所不同

（2）ConA Beads处理样本

（3）—抗孵育

（4）pA-Tn5转座酶酶切

（5）片段标签化并提取DNA

（6）PCR扩增后进行高通量测序

 

四、关键实验细节与注意事项

1、样本质量

    细胞活性需＞90%，原代细胞建议：分离后立即处理；组织样本建议新鲜提取，避免反复冻融，冻存样本需在液氮中快速解冻，减少DNA损伤。

 

2、抗体选择

    必需ChIP级验证抗体

    推荐预实验测试：Western blot或免疫荧光验证特异性

 

3、Tn5反应控制

时间梯度测试：

    5/7/10min优化（过度反应导致背景增高），因为不同的细胞类型、细胞数量、起始材料以及实验条件等，都会对TN5酶的反应效率产生影响。通过时间梯度测试，可以找到最适合当前实验条件的反应时间，使TN5酶能够充分且恰当地切割DNA，生成理想的文库片段，保证实验结果的准确性和可靠性。例如，对于细胞活性较高、数量较多的样本，可能需要相对较短的反应时间；而对于细胞活性较低或数量较少的样本，则可能需要适当延长反应时间。

阴性对照：

（1）IgG对照：使用同型匹配的非特异性IgG抗体进行免疫沉淀，以检测非特异性结合。

（2）无抗体对：不添加任何抗体，只使用蛋白A/G偶联的微球进行处理，以评估背景信号

阳性对照（Positive Control）：

    使用已知有结合位点的抗体，如针对组蛋白H3或H3K4me3的抗体。这些抗体通常在大多数启动子区域都有较强的信号，可以验证实验的有效性。

Input对照（Input Control）：

    从经过交联和片段化的细胞中纯化的DNA，但不添加任何抗体进行富集。Input对照用于标准化ChIP或CUT&RUN富集信号，并解释片段化步骤中的变化。

 

4、特殊样本处理

    冷冻细胞：解冻后立即固定，避免DNA降解

    组织样本：需先制备单细胞悬液

 

五、数据分析流程

    CUT&Tag 的核心是获得样本间靶蛋白结合位点差异信息、全基因组范围的目标蛋白结合位点分析，使用统计学方法，比较两个条件或多个条件下的结合位点差异信息，从中找出与条件相关的染色质功能元件，然后进一步分析这些功能元件以及相关结合蛋白的生物学意义。

分析过程：

❖测序数据质量评估：过滤掉低质量数据，保证数据质量

❖与参考基因组比对：reads分布及比对结果可视化

❖peak峰calling：分析蛋白结合位点

❖motif分析：蛋白结合序列的偏好性

❖peak峰相关基因注释：寻找蛋白潜在调控基因

❖差异peak分析：分析不同样本间差异peak峰

❖相关基因功能分析：相关基因GO, KEGG富集分析

 

六、技术优势与局限

1、优势

    样品起始量需求低：1000个细胞起，实验周期短，信噪比高（背景信号仅为ChIP-seq的1/10）。

    高分辨率：精确捕获结合位点边界。

    无需交联或超声处理：在天然细胞或细胞核上进行，无需CHIP-Seq实验中的交联和超声处理步骤，避免了过度交联或超声可能对抗原表位的影响，防止抗体-蛋白质-DNA复合物无法被免疫沉淀。

    信噪比高：通过限制酶切仅发生在与目标蛋白质结合的DNA区域，有效减少非特异性信号的干扰，获得更高的信噪比，数据更为清晰，结果更具可重复性。

    重复性好：实验重复结果一致性好，peak-calling的效率更高。

 

2、局限

    抗体依赖性：新靶点需严格验证抗体

    未交联或天然条件并不适合所有实验：许多转录因子与DNA结合较弱，对于这些情况，染色质交联和超声处理是检测蛋白质-DNA相互作用的必须步骤；此外，大多数适用于CHIP的抗体经验证可在交联条件下工作，在天然条件下可能无法正常工作，CUT&Tag需要彻底的抗体验证，以确保在未交联条件下的特异性和灵敏度。

    成本因素：商业化Tn5酶价格较高（可自制但工艺复杂）

    多组学整合瓶颈：如何与ATAC-Seq、RNA-Seq数据实现时空同步分析仍是方法论难点。

 

3、应用场景

    组蛋白修饰分析、转录因子结合位点鉴定、增强子解析、多组学验证。

    示例：北京大学生物医学前沿创新中心汤富酬课题组利用CUT&Tag揭示重编程过程中H3K4me3动态变化，为再生医学提供新靶点。

    CUT&Tag技术凭借其高灵敏度和低样本需求，正逐步成为染色质分析的新标准。随着自动化方案的成熟和单细胞应用的拓展，该技术将在表观遗传调控研究中发挥更大价值。金开瑞凭借对表观遗传学研究痛点的深刻理解，成功构建了超灵敏、高稳定性的CUT&Tag技术平台。该平台仅需极少样本量即可精准捕获蛋白质-DNA互作信息，缩短实验周期，显著提升了研究效率。