刚进实验室的新手，最怕导师轻飘飘一句"你去做个互作实验验证一下"。互作实验？哪种互作实验？IP、CoIP、Pull down、RIP、ChIP，五个名字摆在一起，光是分清谁是谁就够头疼的。

别慌。这5个实验虽然名字都跟"沉淀"沾边，但本质上只回答两类核心问题：蛋白和谁结合？蛋白和哪种核酸结合？今天换一个思路，不按编号12345讲，而是按"你在找什么"来分类，一看就懂。

先理清一条主线

按研究对象，这5种实验分成三大阵营：

互作类型	涉及实验	核心追问
蛋白-蛋白	IP、CoIP、Pull down（以蛋白为诱饵，钓蛋白）	蛋白找蛋白伙伴
蛋白-RNA	RIP	蛋白找RNA伙伴
蛋白-DNA	ChIP	蛋白找DNA片段

其中 IP、CoIP、Pull‑down 三者概念极易混淆，本文将对其进行重点拆解；而 RIP 与 ChIP 分别对应蛋白‑RNA、蛋白‑DNA 互作，区分起来相对简单。

IP（免疫沉淀）把目标蛋白单独捞出来

1、原理

IP 技术核心原理：利用特异性抗体识别可溶性目标蛋白抗原，抗体 Fc 段可被 Protein A 或 Protein G 捕获，从而将「目标蛋白‑抗体」复合物锚定在磁珠或琼脂糖凝胶微球固相载体上，从裂解混合液中分离出来。洗涤去除非特异性吸附的杂蛋白后，再洗脱得到目标蛋白，开展后续分析。

2、通俗地说

细胞裂解液就像一个拥有成千上万"用户"的社交平台。抗体是一台只认一个用户ID的精准搜索引擎——你输入目标蛋白的"账号"，它定位到这个人，连同他的资料一并打包提取。磁珠就是承载这次提取的"服务器"，帮你把这个用户从平台里单独调出来。

3、研究目的

① 从细胞裂解物中富集获取目标蛋白； 

② 富集蛋白复合物，为后续实验（如质谱鉴定互作蛋白）做准备。

4、关键特点

只针对目标蛋白开展富集，本身不直接验证蛋白‑蛋白互作；但如果对沉淀得到的蛋白复合物开展质谱，能够筛选潜在互作蛋白，需要配套对照排除非特异结合。

 

CoIP（免疫共沉淀）捞蛋白，顺带验证它的"搭档"

1、核心理念

用蛋白A的抗体把A沉淀下来，如果A在细胞内天然与蛋白B结合成复合物，B会"搭便车"一起被拉下，再用WB检测B即证明A-B互作。

2、适用场景

验证两个已知蛋白在细胞内天然状态下是否存在相互作用——这是体内验证蛋白互作的金标准。

3、关键提醒

① 基于细胞内天然复合物，结果贴近生理状态，真实性高；

② 无法区分直接互作与间接互作——A和C结合、C又和B结合，B同样可能被拉下，造成"A-B直接互作"的假象；

③ 单纯 CoIP‑WB 仅可验证已知蛋白的互作；搭配质谱 CoIP‑MS，可发掘新的互作蛋白。

 

Pull-down在体外证明"是否互作"

1、核心理念

把已知蛋白（诱饵）固定在固相载体上，与含潜在互作蛋白的样品孵育，能直接结合的蛋白（猎物）被捕获，洗脱后鉴定身份。

2、适用场景

① 验证两个蛋白是否"直接结合"，排除间接互作干扰；

② 从裂解液中筛选与诱饵蛋白结合的未知蛋白（配合质谱）。

3、关键提醒

① 体外环境与细胞内不同，需设合理对照排除非特异性结合；

② 常用GST-tag、His-tag等融合蛋白作诱饵，须确保标签不影响蛋白天然折叠与功能。

③ Pull‑down 得到的互作候选是体外条件获得，阳性结果还需要细胞内实验（如 CoIP）进一步验证生理状态下的互作。

注:本文中 Pull-down特指以蛋白为诱饵的蛋白Pull-down。此外还有RNA pull-down、DNA pull-down，分别研究蛋白-RNA、蛋白-DNA互作。

GST pull-down实验

 

RIP（RNA免疫沉淀）蛋白找它的RNA搭档

1、核心理念

用RNA结合蛋白（RBP）的特异性抗体免疫沉淀该蛋白，顺带拉下与之结合的RNA，再用RT-qPCR或测序鉴定RNA身份。

2、适用场景

① 验证某个已知RNA是否与目标RBP结合；

② 通过RIP-seq高通量筛选RBP在细胞内结合的全部RNA。

3、关键提醒

① 全程必须抑制RNase活性——RNA一旦降解，实验就白做了；

② 须设置IgG对照和Input对照，确保信号特异性。

 

ChIP（染色质免疫沉淀）蛋白找它调控的DNA

1、核心理念

先用甲醛交联"冻结"细胞内蛋白-DNA复合物，再将染色质打断成200-500bp片段，用目标蛋白抗体免疫沉淀，解交联释放DNA后用qPCR或测序鉴定。

2、适用场景

① 验证转录因子或组蛋白是否结合特定DNA区域（如基因启动子）；

② ChIP-seq全基因组筛选蛋白结合位点。

3、关键提醒

① 交联条件和片段大小是成败关键——交联过度则难以解交联，片段过大则分辨率下降；

② 必须设Input对照和IgG对照。

 

快速决策指南：三步选对实验

Step 1：确定互作对象

蛋白 vs 蛋白 → 进入Step 2

蛋白 vs RNA → RIP

蛋白 vs DNA → ChIP

 

Step 2：确定验证目的（蛋白-蛋白互作）

证明两个已知蛋白在体内是否互作 → CoIP

证明两个蛋白是否直接结合（体外）→Pull down (如GST pull down或His pull down)

只需富集目标蛋白本身 / 为质谱筛选做准备 → IP

 

Step 3：确定是否需要高通量筛选

已知目标核酸序列 → qPCR验证

想要全基因组 / 全转录组层面筛选 → ChIP-seq / RIP-seq

一句话口诀

IP捞蛋白，CoIP带出伙伴，

Pull down验直接互作，RIP抓蛋白拽RNA，ChIP交联锁DNA。

下次导师再让你"做个互作实验"，先问自己两个问题：我要找谁和谁的互作？在体内还是体外验证？答案一出，实验自然就定了。