【客户文献分享】金开瑞外泌体蛋白质组学助力解析：高糖预处理HUVEC外泌体激活HIF-1α/VEGF通路促进糖尿病缺血皮瓣再生

近期，我司客户单位中国医学科学院整形外科医院尹宁北团队与南开大学孔德领、王伟伟、冯祖健团队合作，在国际学术期刊《Journal of Nanobiotechnology》（影响因子IF 15）上发表了一项研究成果。该论文题为"High Glucose-Primed HUVEC-Derived Extracellular Vesicles Encapsulated in Microgels Boost Diabetic Ischaemic Flap Regeneration via HIF-1α/VEGF Pathway"。

该研究开发了一种以高糖预处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs）来源外泌体（hEVs）为核心、结合甲基丙烯酰化明胶（GelMA）微凝胶递送系统的创新治疗策略，通过激活HIF-1α/VEGF通路，在糖尿病缺血皮瓣模型中实现了显著的促进血管化、缓解氧化应激、调节巨噬细胞极化和提升皮瓣存活率的治疗效果。金开瑞为本研究的蛋白质组学分析提供了技术服务，助力揭示了hEVs相较于普通EVs在货物分子层面的关键差异。

Scheme 1  GelMA@hEVs微凝胶治疗糖尿病缺血皮瓣再生的整体策略示意。高糖预处理稳定HUVECs中HIF-1α，增加外泌体分泌并富集促血管生成货物（HIF-1α、VEGF）；微流控制备GelMA微凝胶包裹hEVs，实现持续局部释放，激活HIF-1α/VEGF通路，促进血管生成、清除ROS并促进巨噬细胞M1→M2极化。

 

核心研究亮点

● 高糖预处理：突破外泌体产量与货物瓶颈

高糖（30 mM D-glucose）预处理使hEVs分泌量提升至正常条件下的约60倍（每10⁵个细胞），单颗粒蛋白含量提升4倍，且促血管生成因子HIF-1α和VEGF显著富集，同时表现出更强的同源细胞内化效率。

● 微凝胶递送系统：环境响应性持续释放

微流控技术制备的GelMA微凝胶（~236 μm）在PBS中7天仅降解20%，在胶原酶II中7天降解达80%，实现"正常组织稳定、缺血创面快速释放"的环境响应性。体内滞留时间从24小时延长至72小时以上。

● 多维疗效与HIF-1α/VEGF机制验证

GelMA@hEVs组第7天皮瓣存活率高达94.63%，远超对照组（34.64%）。使用HIF-1通路抑制剂KC7F2阻断后血管生成显著降低，直接证实HIF-1α/VEGF通路为核心机制。

 

核心研究内容

01、hEVs的制备与表征

研究团队通过差速超速离心从HUVECs培养上清中分离外泌体，正常培养来源记为EVs，高糖预处理来源记为hEVs。TEM显示两者均呈典型杯状形态，平均粒径约130 nm，均表达CD9、CD63、TSG101标志蛋白。关键差异在于：hEVs浓度高出近三倍，按每10^5细胞标准化后产量为正常条件的60倍，单颗粒总蛋白含量为EVs的4倍，且HIF-1α和VEGF浓度均升高。细胞摄取实验显示hEVs在所有时间点的内化效率均显著优于EVs。

Figure 1  EVs和hEVs的提取与表征。(B) NTA粒径分布；(C) TEM形态；(D) 标志蛋白WB验证；(E) Zeta电位；(F) 浓度比较；(G) 每细胞分泌量；(H) 蛋白含量比较；(I-J) HUVEC细胞内化荧光图像及定量分析。

 

02、蛋白质组学分析：揭示hEVs货物特征（金开瑞技术服务）

为探究hEVs相较于普通EVs的生物学功能差异，研究团队委托金开瑞（Wuhan Genecreate Biological Engineering Co., Ltd.）开展系统的定量蛋白质组学分析，涵盖从质谱鉴定到多维度功能注释的完整技术链条。

蛋白质鉴定：采用Label-free nano-LC-MS/MS（Thermo Fisher Scientific平台）分析，EVs和hEVs各鉴定出约200种蛋白质。SDS-PAGE显示整体蛋白组成相当，但Pearson相关性和PCA分析揭示两组间存在显著差异，批次间一致性良好。

GO功能富集：差异蛋白与"血管生成"、"基因表达调控"、"细胞过程"等生物学过程显著相关，与hEVs的促血管化功能高度吻合。

KEGG通路分析：揭示hEVs参与调控四条核心信号通路：PI3K-Akt signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signaling pathway。其中HIF-1和VEGF信号通路直接指向了后续机制验证的核心方向，为聚焦HIF-1α/VEGF轴的深入研究提供了关键组学证据。

COG功能分类：差异蛋白在信号转导机制、重组和修复、能量产生和转换等类别中显著富集。

PPI网络分析：PPI网络分析（STRING数据库）揭示差异蛋白互作网络包含143个节点和208条边，并鉴定出炎症免疫调控（IL7、SLC6A9、ENO2）和血管再生（ANG、FN1、IGF2）两个功能模块。该模块划分与后续GelMA@hEVs促进M2极化及血管形成的功能表型高度一致，为候选效应分子的验证及HIF-1α/VEGF通路的聚焦提供了关键的组学指向。

  hEVs定量蛋白质组学分析（金开瑞技术服务）。(A) SDS-PAGE蛋白分布；(B) 蛋白质鉴定数量；(C-D) Pearson相关性及PCA分析；(E) Venn图；(F) GO富集分析（BP/CC/MF）；(G) KEGG通路富集分析。

 

金开瑞蛋白质组学技术服务要点

① Label-free nano-LC-MS/MS质谱分析 → 鉴定约200种蛋白质，揭示EVs与hEVs显著差异

② GO功能注释（BP/CC/MF） → 鉴定血管生成等关键生物学过程

③ KEGG通路富集 → 揭示HIF-1、VEGF、PI3K-Akt、MAPK四条核心通路

④ COG功能分类 → 补充信号转导、修复、能量代谢维度

⑤ PPI网络构建（143节点/208边） → 鉴定炎症免疫+血管再生两个功能模块

 

03、GelMA微凝胶制备与表征

GelMA通过明胶甲基丙烯酰化反应合成（取代度约59.2%），经微流控技术制备包裹hEVs的微凝胶。GelMA@hEVs微凝胶平均粒径236.36±23.61 μm，单分散性良好，SEM显示表面呈多孔微结构。降解实验显示在PBS中7天仅降解20%，在胶原酶II中7天降解达80%。hEVs释放实验显示在H₂O₂溶液（模拟缺血创面）中120小时累积释放约80%，显著高于PBS中的43.67%，体现了环境响应性释放行为。体内荧光成像显示GelMA@hEVs可将hEVs滞留时间从24小时延长至72小时以上。

Figure 3  GelMA@hEVs微凝胶的制备与表征。(A) 微流控制备示意；(B) 光镜图像；(C) 粒径分布；(D) SEM图像；(E) EDS元素分布；(F) 荧光标记验证hEVs包载；(G-H) 体外降解曲线；(I) hEVs累积释放曲线。

 

04、体外功能验证

GelMA@hEVs在HG条件下显著促进HUVEC增殖、迁移和管形成（连接点数和管总长度接近对照组的两倍），有效清除ROS，并促进巨噬细胞从促炎M1型（CD86+）向促修复M2型（CD206+）极化。转录组测序鉴定出424个差异基因，GSEA分析显示炎症反应显著减弱、HIF-1α信号通路显著增强。WB和RT-qPCR证实GelMA@hEVs显著激活HIF-1α通路并恢复VEGF表达。使用HIF-1通路抑制剂KC7F2阻断后，血管生成能力显著降低，直接确认HIF-1α/VEGF通路的核心介导作用。

  GelMA@hEVs调控HG条件下HUVEC血管生成的机制。(A) PCA分析；(B) 火山图；(C) 热图；(D) GO富集；(E) KEGG富集；(F-G) HIF-1α和VEGF蛋白WB验证；(H) RT-qPCR验证血管再生相关基因；(I-J) HIF-1抑制剂处理后管形成能力评估。

 

05、体内药效验证

在STZ诱导的糖尿病小鼠缺血皮瓣模型中，GelMA@hEVs组第7天皮瓣存活率达94.63±5.37%，远高于对照组（34.64±14.56%）和GelMA组（75.08±13.88%）。激光多普勒成像显示GelMA@hEVs组血管再生和血流运输能力最强，第7天血流灌注接近正常组织。组织学评估显示完整的上皮结构、丰富血管组织和排列整齐的胶原纤维。免疫荧光染色显示，GelMA@hEVs组M1型巨噬细胞（CD86+）减少、M2型（CD206+）增多，同时微血管密度（CD31+/α-SMA+）显著增加，且HIF-1α和VEGF阳性细胞数明显上升，验证了该策略在体内促进血管新生和免疫重塑的双重作用。主要器官H&E染色和血液生化分析均无异常，证实优异生物相容性。

  GelMA@hEVs微凝胶促进缺血皮瓣存活。(A) 糖尿病缺血皮瓣模型构建及治疗示意；(B) 术后第0、1、3、7天皮瓣照片及激光散斑图像；(C) 皮瓣存活率定量；(D) 血流灌注定量；(E) H&E和Masson染色。

 

结论与展望

该研究通过HG应激预条件化HUVECs生成hEVs，大幅提升外泌体产量并富集HIF-1α、VEGF等促再生货物，结合微流控GelMA微凝胶递送系统实现环境响应性持续释放，在糖尿病缺血皮瓣模型中取得了94.63%的皮瓣存活率，为糖尿病创面修复提供了切实可行的工程化外泌体治疗方案。

金开瑞提供的蛋白质组学分析在本研究中发挥了关键的桥梁作用：一方面，从分子层面描绘了hEVs的独特货物特征（富集HIF-1α/VEGF等通路蛋白）；另一方面，为后续机制验证提供了精准的切入点，使研究能够高效地聚焦于HIF-1α/VEGF核心通路，充分体现了蛋白质组学在工程化外泌体功能解析中的不可或缺性。

感谢客户团队的信赖与协作，我们很荣幸能为该研究的蛋白质组学分析提供技术支持。

如需了解更多外泌体蛋白质组学技术服务详情，请联系金开瑞。

 

参考文献

[1] Ding S, Liu S, Kang S, et al. High Glucose-Primed HUVEC-Derived Extracellular Vesicles Encapsulated in Microgels Boost Diabetic Ischaemic Flap Regeneration via HIF-1α/VEGF Pathway. Journal of Nanobiotechnology (2026). DOI: 10.1186/s12951-026-04776-6