阿尔茨海默病治疗新探索：黄芪细胞外囊泡＋pH 响应水凝胶，实现无创鼻 - 脑递送

最近，常州市第二人民医院苏丹 / 邢正团队在《Chemical Engineering Journal》期刊上的一篇题为"Engineered Astragali Radix-extracellular vesicles/hydrogel ameliorates Alzheimer's disease by alleviating endoplasmic reticulum stress in cholinergic neuron"的研究，报道了一种鼻 - 脑靶向递送系统 ——RVG/AR-EVs@OPFP。该系统由狂犬病病毒糖蛋白（RVG）肽修饰的黄芪来源细胞外囊泡（AR-EVs）包载于 pH 响应型水凝胶（OPFP）中构成，经鼻内给药绕过血脑屏障，显著增强囊泡在脑内的富集；通过抑制 PERK-JNK-CHOP 信号通路减轻胆碱能神经元内质网应激，减少神经元凋亡，恢复乙酰胆碱释放，从而有效改善 APP/PS1 小鼠的认知功能障碍。

 

01、研究价值

AD是最常见的神经退行性疾病，全球影响超5000万人，现有药物仅能暂时缓解症状，无法阻止疾病进程。黄芪传统上用于改善认知功能，其提取物可保护胆碱能神经元、恢复胆碱能神经传递，但传统制剂生物利用度低、稳定性差。黄芪来源细胞外囊泡（AR-EVs）天然携带黄芪活性成分，却面临血脑屏障穿透难和脑靶向性不足的瓶颈。RVG肽可特异性结合血脑屏障内皮细胞和神经元上的nACh受体，介导囊泡入脑；鼻内给药经鼻脑轴可绕过血脑屏障，但易被黏膜纤毛清除，水凝胶载体可实现缓释并延长鼻腔滞留时间。

本文创新性地将RVG肽修饰的脑靶向工程化AR-EVs与pH响应型水凝胶相结合，构建了RVG/AR-EVs@OPFP鼻脑递送系统。系统表征证实了水凝胶的可注射性和pH响应缓释特性，RVG修饰赋予AR-EVs脑靶向能力。在APP/PS1小鼠中，鼻内给药恢复了内侧前额叶皮层（mPFC）的乙酰胆碱释放，改善了时间顺序识别记忆，减轻了认知缺陷。机制上，转录组学和分子验证揭示该系统通过抑制PERK-JNK-CHOP信号通路减轻胆碱能神经元内质网应激，减少内质网应激介导的神经元凋亡，恢复正常内质网形态。该研究为AD治疗提供了一种有前景的无创递送策略。

 

02、主要研究思路

总体设计：分离 AR-EVs → RVG 肽疏水锚定修饰 → 席夫碱交联构建 OPFP 水凝胶包载囊泡 → 经鼻给药进入脑内 → 抑制 PERK-JNK-CHOP 通路缓解胆碱能神经元 ER 应激 → 恢复 ACh 释放与认知功能（下图）

 

01、AR-EVs的表征与RVG表面修饰

AR-EVs 提取与 RVG 修饰：黄芪饮片经水回流提取（两次，各 1.5 h）、浓缩后依次梯度离心（300 g/10 min、3000 g/30 min、10,000 g/30 min），上清于 150,000 g 超速离心 1.5 h 沉淀得到 AR-EVs。RVG 肽（狂犬病病毒糖蛋白 29 肽，靶向 BBB 内皮与神经元高表达的 nAChR）经 EDC/NHS 活化接上硬脂酰基，通过疏水作用插入囊泡脂质双层完成表面修饰。

表征结果：TEM 显示 AR-EVs 与 RVG/AR-EVs 均为典型杯状结构、约 100 nm（NTA 粒径分布一致，修饰前后平均粒径与颗粒浓度无显著差异）；CLSM 证实 DiI 膜荧光与 FITC-RVG 荧光共定位；WB 检出植物囊泡阳性标志物（HSP70、PIP2;1、TET8）而阴性标志物 Rubisco 缺失，提示 RVG 修饰未破坏囊泡完整性与纯度；脂质组学显示主要脂质类别为甘油酯、鞘脂与甘油磷脂，其中甘油三酯（TG）占比最高，其次为神经酰胺（Cer）与磷脂酰胆碱（PC），支撑膜结构的稳定性与生物活性。

OPFP 水凝胶：由高碘酸钠氧化普鲁兰糖（OxP）与 F127-PEI 嵌段共聚物经席夫碱反应交联而成。具备温度响应溶胶 - 凝胶转变（转变温度约 29.8 ℃，低于体温，经鼻给药后在鼻腔原位快速成胶）、可注射性，以及良好的细胞相容性（原代神经元与 BV2 小胶质细胞活力保持在 90% 以上），并据此筛选确定 OPFP-2（OxP:F127-PEI = 5%:10%）为最优配方。

pH 响应缓释：席夫碱键在酸性条件下加速断裂。BCA 定量与 DiI 荧光成像双重验证显示，在模拟鼻黏膜酸性的 pH 5.5 条件下 AR-EVs 自水凝胶持续稳定释放达 12 天，而在中性 pH 7.4 条件下释放显著减慢，实现 "酸性环境促释、中性环境防漏" 的缓释模式，兼顾鼻腔滞留时间与生物利用度。

图1. AR-EVs的表征与RVG表面修饰

图2. OPFP水凝胶的制备与结构表征

 

02、体内脑靶向效率评价

高效靶向脑递送对提高AD治疗效果至关重要。作者在小鼠鼻内给药后评估了四组制剂（AR-EVs、RVG/AR-EVs、AR-EVs@OPFP、RVG/AR-EVs@OPFP）的体内脑靶向效率。实时荧光成像显示，鼻内给药后3小时即可在脑部检测到明显荧光信号，且信号随时间逐渐增强，脑部荧光强度在12小时达到峰值，24小时仍可观察到，表明在脑组织中具有较长滞留时间。

定量分析表明，RVG/AR-EVs@OPFP组在所有时间点的脑部荧光强度均显著高于其他三组。同时，各组肝脏中的荧光信号相对较低，提示全身分布有限，脱靶效应减少。这些结果表明，RVG肽的主动靶向作用与水凝胶缓释的协同作用显著提高了AR-EVs的脑递送效率，为后续AD认知改善治疗奠定了基础。

图3. 鼻内给药后AR-EVs的体内脑靶向效率

 

03、APP/PS1小鼠时间顺序识别记忆与体内乙酰胆碱释放分析

APP/PS1 小鼠分为 PBS、AR-EVs@OPFP、RVG/AR-EVs@OPFP 三组，每 7 天鼻内给药 1 次、共 4 次，末次给药后 7 天进行行为测试；行为测试前 4 周已向 mPFC 立体定位注射 AAV9-hsyn-ACh3.0 探针，用于光纤光度法实时记录 ACh 释放。TOR 测试按 "样本阶段 1（5 min）→ 间隔 1 h → 样本阶段 2（5 min）→ 间隔 3 h → 测试阶段（5 min）" 三阶段进行。结果显示：RVG/AR-EVs@OPFP 组辨别率显著升高（vs PBS p < 0.001），AR-EVs@OPFP 组亦有中等改善，说明 RVG 修饰进一步增强了记忆恢复效果；物体探索期间 mPFC 的 ACh 释放幅度（ΔF/F₀）在 RVG/AR-EVs@OPFP 组显著增强。三组间总探索时间、总移动距离与平均速度均无统计学差异，排除了运动活性或探索动机改变对认知结果的干扰。

图4. APP/PS1小鼠时间顺序识别记忆与体内乙酰胆碱释放分析

 

04、转录组学分析揭示关键调控通路

对三组小鼠脑组织行 RNA-seq：治疗组与 PBS 组相比各检出千余个差异表达基因（1383 与 1419 个），而两种制剂处理组之间差异基因仅百余个（174 个），且聚类显示两治疗组表达模式高度相似、与 PBS 组明显区分，说明两种制剂均有效逆转了疾病相关的转录紊乱。GO 富集显示差异基因集中于 ER 稳态、神经元存活、突触功能与细胞应激反应等生物学过程；火山图中可见 Casp3、CHOP（Ddit3）、XBP1、JNK、Bip（Hspa5）、MANF 等 ER 应激与凋亡关键基因。GSEA 进一步确认：突触囊泡循环（p = 0.0031，NES = −2.26）与胆碱能突触（p = 0.0039，NES = −1.85）通路在 PBS 组中病理性下调，治疗后表达得到恢复。

 图5. APP/PS1小鼠脑组织转录组学分析

 

05、分子与形态学机制验证

免疫荧光：以 ChAT 标记胆碱能神经元、CHOP 标记 ER 应激细胞。两治疗组 CHOP 阳性细胞数及 CHOP/ChAT 双阳性细胞数（即处于 ER 应激状态的胆碱能神经元）均较 PBS 组显著减少（vs PBS p < 0.001）。

超微结构：TEM 显示 PBS 组内质网肿胀、扩张，治疗组恢复为正常细长形态，ER 扩张程度定量显著下降（vs PBS p < 0.001）。

蛋白水平：WB 显示两治疗组 p-PERK/PERK 比值、JNK 与 CHOP 表达均显著下调，且 RVG/AR-EVs@OPFP 组下调幅度优于 AR-EVs@OPFP 组 —— 即通过抑制 PERK 磷酸化起始、阻断 JNK/CHOP 介导的促凋亡级联，缓解胆碱能神经元 ER 应激，与转录组预测一致。

图6. RVG/AR-EVs@OPFP减轻内质网应激并保护胆碱能神经元

03、结论 

1.成功构建了RVG修饰的黄芪细胞外囊泡包载于pH响应水凝胶的鼻脑递送系统（RVG/AR-EVs@OPFP），该系统具有良好的可注射性、生物相容性和pH响应缓释特性，RVG修饰不改变AR-EVs的基本结构和特性。

2.体内荧光成像证实，鼻内给药后RVG/AR-EVs@OPFP显著增强了囊泡在脑内的富集，同时减少了全身分布，表现出优异的脑靶向效率。

3.在APP/PS1小鼠中，RVG/AR-EVs@OPFP有效恢复了mPFC的乙酰胆碱释放，增强了时间顺序识别记忆，改善了认知缺陷，且不影响运动活动，具有良好的系统安全性。

4.转录组学分析和机制验证揭示，RVG/AR-EVs@OPFP通过抑制PERK-JNK-CHOP信号通路，减轻胆碱能神经元内质网应激，减少内质网应激介导的神经元凋亡，恢复正常内质网形态，从而发挥神经保护作用。

该研究创新性地将传统中药黄芪的细胞外囊泡与现代纳米工程技术相结合，开发了一种安全有效的无创鼻脑靶向递送策略，为阿尔茨海默病的治疗提供了有前景的临床前候选方案，也为植物源外泌体在中枢神经系统疾病中的应用开辟了新方向。

 

文献来源：Zhao C, Li T, Yang H, Fang H, Song X, Wang Y, Jiang X, Wang L, Su D, Xing Z. Engineered Astragali Radix-extracellular vesicles/hydrogel ameliorates Alzheimer's disease by alleviating endoplasmic reticulum stress in cholinergic neuron. Chemical Engineering Journal. 2026; 549: 182835.