还在手动设计引物？金开瑞「引物设计工具」上线，3 分钟出方案，一键导出订购单

做 PCR / qPCR 实验，最费时间的往往不是跑胶，而是设计引物：

要查基因序列，翻 NCBI，找 RefSeq 转录本；

要挑保守区，比对多条 CDS；

要算 Tm、GC、产物长度，还要避开 SNP 和内含子；

好不容易设计好，还得手动填订购单……

现在，金开瑞把这一整套流程，做成了一个在线工具。

不用下载软件，不用注册登录，打开网页就能用。

工具入口：【https://www.genecreate.cn/primer-design/】（或点击阅读原文可以一键直达）

（或从金开瑞官网「技术支持 → 分子生物学分析工具 → 引物设计工具」进入）

01、这个工具能做什么？

一句话概括：从基因查询到引物设计，再到订购单导出，一站完成。

功能	说明
基因查询	输入物种 + 基因名，自动检索 NCBI Gene，获取关联 RefSeq 转录本序列
共同序列设计	对多个转录本做多序列比对，在共有保守区设计一套通用引物
跨内含子设计	两条引物分别位于不同外显子，降低基因组 DNA 污染风险
多种实验类型	常规 PCR、SYBR Green qPCR、TaqMan qPCR
参数可调	引物长度、Tm、GC 含量、产物长度、目标区域、排除区域
结果导出	支持导出 CSV，以及直接导出引物订购单 .xlsx

 

02、功能亮点：共同序列设计

这是本工具最值得讲、也最能体现专业度的功能。

为什么需要它？

很多基因并不止一个转录本。比如人 TP53，在 NCBI 上就有 20 多个 RefSeq 转录本——它们来自同一个基因，但因为可变剪接，序列长度、外显子组成都不一样。

如果你只针对某一个转录本设计引物，做 qPCR 时，其他转录本可能检测不到，导致定量结果偏低，甚至漏检。

它怎么工作？

勾选「共同序列设计」后，工具会自动：

把你选择的全部转录本放在一起做多序列比对；

找出它们在序列上完全一致的区域（即「共有区」或「保守区」）；

在这些共有区里，用 Primer3 设计引物。

这样设计出来的引物，在所有目标转录本中都存在，一套引物就能同时扩增全部转录本——这就是「通用引物」。

什么时候勾？什么时候不勾？

场景	是否勾选	原因
检测某基因的总表达量，不区分 isoform	✅ 勾	需要一套引物覆盖所有转录本
基因有多个可变剪接体，想全部检测到	✅ 勾	只有共有区引物才能同时扩增全部
只研究经典全长转录本（如 TP53 的 NM_000546）	❌ 不勾	只需针对这一条设计
想区分不同 isoform	❌ 不勾	共同序列设计会找共有区，反而无法区分
基因只有一个 RefSeq 转录本	❌ 不勾	只有一条，比对没有意义

一句话记住：

多转录本，需全面覆盖 → 勾「共同序列设计」；

只盯一个转录本 → 不勾，直接选那一条。

小提示

转录本越多，共有区越短，能设计出的候选引物就越少。如果候选太少，可以

放宽产物长度或 Tm 范围或减少纳入的转录本数量。

03、使用前准备

你只需要准备两样东西：

想研究的基因名，例如：TP53、GAPDH、Actb；

物种，例如：人、小鼠、大鼠、拟南芥、水稻等。

如果已经有现成序列，也可以直接粘贴 FASTA 序列，跳过基因查询步骤。

04、分步操作指南

第一步：打开工具，进入首页

打开链接：【工具链接】

页面分为左右两块：

左侧：基因查询——用于从 NCBI 获取序列；

右侧：引物设计——用于填写模板、设置参数、生成引物。

如果你已经有序列，可以直接跳到第三步。

第二步：查询基因，载入序列

在左侧「基因查询」区域：

选择物种：下拉选择，例如「人（Homo sapiens）」；

输入基因名：例如 TP53；点击 「查询基因与序列」。

稍等几秒，下方会列出该基因关联的 RefSeq 转录本。

选择你需要的转录本；

点击后，序列会自动载入右侧的「模板序列」框中。

（提示：TP53 这类研究透彻的基因，可能一次列出 20 多条转录本，这是正常的——工具默认全部载入，便于后续做「共同序列设计」。如果你只研究经典全长，只保留 NM_000546 即可。）

共同序列设计：对全部已载入 CDS 比对，在各转录本共同保守区设计一套通用引物；

跨内含子设计：两条引物分别位于不同 CDS 外显子，降低基因组 DNA 扩增风险。

建议：

做 qPCR 检测总表达量 → 两个都勾；

只研究特定转录本 → 只勾「跨内含子设计」；

做普通 PCR → 按需选择。

第三步：填写模板与序列，填写设计参数

在右侧「引物设计」区域：

序列名称：可填可不填，例如 TP53_NM_000546；

模板序列 / 多序列 FASTA：

从基因查询载入的序列会自动填入；

也可以手动粘贴单条 DNA，或包含多个记录的 FASTA；

在「实验类型」下拉框中，选择：

常规 PCR：普通扩增；

SYBR Green qPCR：染料法荧光定量；

TaqMan qPCR：探针法荧光定量。

选择后，工具会自动应用推荐参数，你也可以在下方「设计参数」中手动修改。

如果选择 TaqMan qPCR，还会出现探针参数区域，可设置探针长度、Tm、GC 含量。

第四步：开始设计，查看与筛选候选引物

点击 「开始设计」。

服务器端会调用 Primer3 进行计算，几秒后弹出「候选引物对」窗口。

结果窗口中，每组候选引物包含：

正向引物 F（5′→3′）

反向引物 R（5′→3′）

引物长度、Tm、GC 含量

产物长度、位置

评分与筛选统计（可展开「查看 Primer3 筛选统计」）

你可以：

点击 「导出 CSV ↓」保存全部结果；

勾选需要的候选，准备导出订购单。

提示：如果勾选了「共同序列设计」，结果顶部会显示「覆盖 N 条转录本 · 共同 X BP · Y PAIRS」。转录本越多，共有区越短，候选对数可能越少——这是正常现象，说明工具已经在你设定的参数下找出了全部合格方案。

第五步：导出订购单（.xlsx）

在结果窗口上方的「订购候选选择」区域：

选择需要的候选：

可勾选 「合并相同序列」，避免重复；

展开「订购参数」，填写：

总量（O.D）

分装管数

纯化方式（RPC / OPC / DSL / PAGE / HPLC）

5′修饰、3′修饰、其他修饰

点击 「导出订购单 .xlsx ↓」。

下载的 Excel 可直接发给金开瑞下单，或导入在线订购系统。

注意：TaqMan 订购单只包含 F/R 引物，不包含探针；探针需另行确认荧光和淬灭修饰后订购。

这个工具是金开瑞为科研用户打造的免费在线工具，目标是让引物设计这件事更简单、更规范、更高效。如果你在使用中遇到问题，或有功能建议，欢迎在评论区留言，或联系我们的技术支持。