最近发表在《Nutrients》期刊上的一篇题为《Green Onion-Derived Exosome-like Nanoparticles Prevent Ferroptotic Cell Death Triggered by Glutamate: Implication for GPX4 Expressio》的文章首次揭示洋葱来源外泌体样纳米颗粒（GDENss）通过调控GPX4表达与活性，拮抗谷氨酸诱导的铁死亡，此研究为开发植物源纳米药物治疗铁死亡相关疾病提供了新思路。

一.研究价值

    铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的程序性细胞死亡，由铁和脂质过氧化物的过度积累引起，与神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）相关，而其中谷氨酸（Glutamate）通过抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运体（System Xc⁻），降低细胞内谷胱甘肽（GSH）水平，抑制GPX4活性，从而诱发铁死亡。植物源外泌体样纳米颗粒（PDENs）具有生物相容性高、低毒性、富含生物活性成分（如小RNA、蛋白质）的优势，是新型药物递送载体。洋葱（Allium fistulosum）富含硫化物（蒜素、蒜氨酸）和类黄酮（槲皮素、山奈酚），具抗氧化和抗炎特性，但其外泌体（GDENs）的神经保护作用尚未研究，此研究为开发植物源纳米药物治疗铁死亡相关疾病提供新策略。

二.主要研究思路

01、GDENs的分离和表征

    通过差速离心对磨碎的葱提取物进行 PEG 沉淀以去除大碎片和颗粒来获得 GDENs（图1A）。为了表征分离的 GDENs，分析了粒径和 zeta 电位。DLS 分析和 zeta 电位测量显示：GDENs 的平均粒径为 167.4 nm，zeta 电位值为 -16.06 mV（图1B，C）。TEM 图像显示，GDENs 具有均匀的圆形，直径小于 200 nm（图1D）。进行总 RNA 电泳以鉴定 RNA，它们是植物来源的外泌体样纳米颗粒 （PDEN） 的特征成分。电泳显示 100 bp 或更小的条带。RNase 处理导致条带完全消失，表明它们含有 RNA（图1E）。此外，GDENs 蛋白提取物的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示蛋白质具有较宽的分子量范围（ 图1F）。分离的 GDENs 浓度为 4.45 μg/μL。

图 1.GDENs 的分离和表征

02、GDENs 抑制谷氨酸诱导的HT-22细胞铁死亡

为了确定后续实验的GDENs 浓度，使用 HT-22 细胞进行 MTT 和 LDH 释放试验，分别测量细胞活力和细胞毒性。虽然没有观察到细胞毒性，但细胞活力在 100 μg GDENs 时趋于降低，尽管降低并不显著（图 2A、B）。因此，在随后的实验中使用了 50 μg GDENs。

图 2. 在 HT-22 小鼠海马神经元中评估 GDENs 的细胞毒性

    为了评估GDENs 是否抑制谷氨酸诱导的 HT-22 细胞中铁死亡，在用 4 mM 谷氨酸孵育细胞后进行了 MTT 和 LDH 释放测定，有或没有 50 μg GDENs（图3A、B）。此外，即使在谷氨酸处理后 8 小时添加 GDENs也赋予了显著的细胞保护作用（图3C，D）。

图 GDENs 抑制谷氨酸诱导的 HT-22 细胞死亡

03、GDENs 抑制谷氨酸诱导的钙内流

    细胞内钙内流被认为是铁死亡诱导的细胞死亡之前的特征之一。为了研究GDENs 是否抑制细胞内钙内流，利用 Fluo-3AM 荧光染色。荧光显微镜分析显示，谷氨酸处理增加了钙流入细胞，如 Fluo-3AM 荧光升高所示，而与 GDENs 的共同处理减少了谷氨酸诱导的钙内流（图4A）。为了更准确地定量，作者采用流式细胞术来测量 Fluo-3AM 的平均荧光强度。与荧光显微镜的结果一致，从流式细胞术获得的结果证实，用 GDENs 处理显著减弱了谷氨酸诱导的 HT-22 细胞中钙内流（图4B，C）。

图 4. GDENs 抑制谷氨酸触发的 Ca²⁺流入。

04、GDENs 通过调节铁代谢相关蛋白来降低细胞内铁水平

    为了确定GDENs 是否防止谷氨酸诱导的铁稳态破坏，使用基于铁的定量方法测量细胞铁水平。虽然谷氨酸处理后细胞内铁水平显著增加，但GDENs 有效地逆转了谷氨酸处理的效果（图5A、B）。已经鉴定出几种与细胞内铁代谢相关的蛋白质，包括转铁蛋白受体 1 （TfR1）、铁转运蛋白 1 （FPN1）、二价金属转运蛋白 1 （DMT1） 和铁蛋白。这些铁代谢相关蛋白的蛋白质印迹分析表明，谷氨酸处理后它们的水平增加，而与 GDENs 的共处理则逆转了它们的水平（图5C-E）。另一方面，谷氨酸诱导的 FPN1 表达降低通过与 GDENs 的共处理而被逆转（图5F）。

图 5.  GDENs 通过调节铁代谢相关蛋白表达来降低细胞内铁水平

05、GDENs通过上调 GPX4表达抑制谷氨酸诱导的脂质过氧化

    为了评估GDENs 是否抑制谷氨酸诱导的脂质过氧化，作者在有或没有GDENs 的谷氨酸处理后使用 Bodipy-C11 荧光染色测量了过氧化脂质的量。在荧光显微镜下，作者观察到谷氨酸处理组的荧光强度高于对照组，但在与GDENs 共处理时荧光强度显著降低（图6A），表明 GDENs抑制谷氨酸诱导的脂质过氧化。通过流式细胞术测量荧光强度，结果得到了更准确的确认（图6B，C）。此外，作者研究了 GPX4 的表达。作者结果表明，GDENs 处理逆转了谷氨酸诱导的 GPX4 表达降低，GPX4 是一种参与铁死亡的主要抗氧化酶 （图6D）。此外，GDENs 处理显著增加了谷胱甘肽的合成，谷胱甘肽是一种关键的抗氧化剂，可作为 GPX4 的底物以防止脂质过氧化（图6E）。这些结果表明，GDENs 介导的对谷氨酸诱导的铁死亡的保护可能至少部分是通过 GPX4 表达的上调和谷胱甘肽合成的增加介导的，从而减少脂质过氧化和细胞死亡。

图 6.GDENs 抑制谷氨酸诱导的脂质过氧化

    该研究首次揭示洋葱来源外泌体样纳米颗粒（GDENss）通过三重机制拮抗铁死亡：（1）调控铁代谢蛋白（↓TfR1/DMT1，↑FPN1），降低胞内铁积累（2）上调GPX4表达，增强抗氧化能力；（3）促进谷胱甘肽合成，抑制脂质过氧化。这些发现将为GDENs作为安全和天然物质治疗铁死亡引起的疾病研究提供支持。

GDENss中的小RNA/蛋白质如何调控GPX4尚需深入研究；需在动物模型（如脑缺血模型）中验证、GDENss的神经保护作用以及长期生物相容性需进一步验证。  

文献：Yoon HJ, Won JP, Lee HG, Seo HG. Green Onion-Derived Exosome-like Nanoparticles Prevent Ferroptotic Cell Death Triggered by Glutamate: Implication for GPX4 Expression. Nutrients. 2024 Sep 26;16(19):3257.