三篇顶刊论文，同一个技术选择——BiFC如何破解植物蛋白互作难题？

蛋白质是生命活动的执行者，而蛋白质之间的相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）构成了细胞内复杂的「社交网络」。

几乎所有的生物学过程，从信号传导到代谢调控，都依赖于这些精密的蛋白质互作网络。正如Ren等人（2024）在综述中所指出的，蛋白质互作网络的紊乱与多种疾病和生理异常密切相关。

在植物科学领域，随着拟南芥、水稻等模式植物全基因组测序的完成，解析蛋白质之间的相互作用已成为后基因组时代的重要课题。研究植物激素信号通路（如乙烯、生长素、赤霉素、脱落酸）、生物与非生物胁迫响应等过程，都离不开对蛋白互作的深入理解。

今天，我们要介绍的双分子荧光互补技术（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC），就是研究植物蛋白互作的得力工具。

 

什么是BIFC技术？

BiFC技术的原理十分巧妙：将一个完整的荧光蛋白（如YFP）在特定位置切割成两个不发光的片段（N端片段和C端片段），分别与待研究的两个目标蛋白（蛋白A和蛋白B）融合表达。

核心机制：

●如果蛋白A和蛋白B能够发生相互作用，它们会在空间上相互靠近

●这种靠近使得原本分离的荧光蛋白两个片段重新组装成完整的、具有荧光活性的蛋白

●通过荧光显微镜观察是否出现荧光信号，即可判断蛋白间是否存在相互作用

 

常见荧光蛋白选择：

➤Venus/YFP：最常用的BiFC荧光蛋白，荧光强且背景敏感度低

➤CFP/ECFP：青色荧光蛋白，适用于多色BiFC或与YFP组合进行FRET分析

➤mCherry/mRFP：红色荧光蛋白，穿透性强，适用于深层组织成像

 

实战案例：BIFC技术如何验证植物蛋白互作?

01、案例一：揭秘丛枝菌根共生的「信号密码」

文献名称：Yeast two-hybrid-sequencing and bifluorescence complementation resources for assessing protein–protein interactions in arbuscular mycorrhizal roots: CKL2 as a case study

发表期刊：New Phytol     IF（8.7）

研究背景：丛枝菌根（AM）共生是植物与真菌之间的重要互作关系，植物通过这一共生关系获取磷等矿物质营养，而真菌则从植物获取碳源。这是自然界中最普遍的共生关系之一，但参与这一过程的蛋白互作网络尚不清楚。

BIFC实验：作者利用蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）与Diversispora epigaea 的菌根根系构建了Y2H文库，并结合Y2H-seq筛选体系与BiFC载体系统，以CKL2激酶为研究对象进行案例分析。

验证结果：

➤Y2H-seq筛选鉴定出三个14-3-3蛋白为CKL2的主要互作伴侣

➤BiFC实验在 Rhizophagus irregularis 侵染的菌根根细胞中证实了CKL2与 14-3-3A 蛋白在丛枝周围膜（PAM）位置的直接相互作用

➤利用PT4启动子驱动的RNAi 进行初步功能验证，同时靶向14-3-3A/B/C三个成员时可观察到菌根定植率下降约31%，暗示14-3-3蛋白在AM共生中具有一定功能，但成员间存在明显的功能冗余

亮点：该研究建立的Y2H-seq与BiFC联用策略，为大规模解析共生相关蛋白互作网络奠定了基础！

图1. 利用双分子荧光互补（BiFC）系统检测蒺藜苜蓿根细胞丛枝菌根共生中的蛋白互作

 

02、案例二：生长素如何「抑制」尼古丁合成？

文献来源：Auxin-Induced Nicotine Inhibition Is Mediated by NaARF5 Through the Suppression of NaERF1-Like Expression and Interaction With NaERF1-Like in Nicotiana attenuata

发表期刊： Plant Biotechnol J    IF（12.8）

研究背景：生长素（auxin）能强烈抑制烟草尼古丁合成，这是植物激素调控次生代谢物的典型案例。尼古丁是烟草重要的防御性生物碱，对昆虫具有毒性。但具体调控机制一直是个谜！

BIFC验证：作者利用酵母双杂交（Y2H）筛选发现NaARF5（生长素响应因子） 可与 NaERF1-like（乙烯响应转录因子） 相互作用，并进一步通过BiFC 和分裂荧光素酶互补成像（LCI） 验证了这一互作。

验证结果：

➤通过酵母双杂交筛选发现NaARF5与NaERF1-like存在互作

➤BiFC和荧光素酶互补(LCI）实验共同证实了两者在细胞核内的直接结合

➤机制研究表明，NaARF5发挥双重抑制功能：一方面转录水平上抑制 NaERF1-like 基因的表达；另一方面蛋白水平上通过与NaERF1-like物理互作，削弱其对尼古丁合成关键酶基因（如 NaPMT1.1、NaQPT2）启动子的结合与转录激活能力

➤CRISPR-Cas9敲除NaARF5导致尼古丁含量增加1.6-2.5倍，而过表达则显著降低尼古丁积累。

亮点：该研究不仅阐明了植物激素调控次生代谢的分子通路，也为烟草品质改良提供了理论基础和育种靶点！

图2. A：BIFC实验证明了NaARF5与NaERF1样蛋白在体内的相互作用。B：LCI测定显示了NaARF5与NaERF1样体体内的相互作用

 

03、案例三：自噬体与液泡融合的「分子开关」

文献来源：The SNARE protein SYP22 in Arabidopsis interacts with ATG8 to promote the autophagosome-vacuole fusion

发表期刊：Autophagy   IF （18.6）

研究背景：细胞自噬是植物应对逆境（如饥饿、干旱、病原菌入侵）的重要机制。自噬体与液泡的融合是自噬过程的关键步骤，决定了自噬降解的效率。

BIFC锁定关键互作：作者利用BiFC技术研究了SNARE蛋白SYP22与自噬相关蛋白ATG8之间的相互作用。

验证结果：

➤BiFC实验证实SYP22与ATG8在液泡膜位置存在直接相互作用，且该互作依赖于SYP22蛋白N端Habc结构域中的三个ATG8相互作用基序（AIM）

➤该互作促进了自噬体与液泡的融合过程

➤遗传分析表明SYP22功能缺失会导致自噬体积累，影响自噬通量

➤同时BiFC与免疫共沉淀（Co-IP）实验还证实SYP22与另一个SNARE蛋白VAMP724存在互作，提示二者可能形成trans-SNARE复合物介导融合

亮点：该研究不仅揭示了ATG8蛋白通过与SNARE蛋白互作直接参与自噬体-液泡融合这一新功能，还为植物自噬研究提供了一个可用于蛋白酶K保护实验的 syp22 阳性对照材料！

图3. 过Co-IP和BiFC实验，证明SYP22分别与ATG8和VAMP724互作

（A） Co-IP验证SYP22与ATG8A结合。

（B） SYP22结构含3个ATG8结合基序（AIM）。

（C–D） BiFC证实ATG8A与SYP22在质膜/液泡膜互作，且依赖AIM基序。

（E） Co-IP验证SYP22与VAMP724结合。

（F–G） BiFC显示ATG8A存在时，SYP22与VAMP724互作信号增多，且定位于ATG8A斑点周围。

（H） 模型总结：SYP22作为SNARE组分，介导自噬体与液泡的融合。

 

黄金法则：多重验证让结论更可靠

正如Ren等人（2024）在综述中强调的，单一方法的结果往往不够有说服力。研究人员通常会采用多种方法相互验证，形成完整的证据链：

方法	特点	适用场景
酵母双杂交（Y2H）	大规模筛选互作伴侣	初步筛选
双分子荧光互补（BiFC）	活细胞内可视化验证	亚细胞定位
荧光素酶互补（LCI）	灵敏的定量检测	互作强度分析
免疫共沉淀（Co-IP）	体内互作的生化验证	复合物鉴定
GST Pull-down	体外直接互作验证	直接结合确认

推荐组合策略：

1.Y2H筛选 → 发现潜在互作伴侣

2.BiFC验证 → 确认活细胞内互作及定位

3.Co-IP验证 → 生化水平确认复合物存在

4.遗传分析 → 验证互作的生物学功能

 

BIFC技术的独特优势

1. 活细胞内的「实时影像」

不同于需要裂解细胞的Co-IP等方法，BiFC可以在活细胞内直接观察蛋白互作，避免了细胞破碎可能导致的蛋白构象改变或非特异性结合。

 

2. 亚细胞定位的「精准导航」

荧光信号的位置直接反映了蛋白互作发生的亚细胞区域。例如在Ivanov等人（2025）的研究中，BiFC信号出现在丛枝周围膜（PAM）；而Yang等人（2025）的BiFC信号则位于细胞核。

 

3. 弱相互作用的「捕捉高手」

BiFC对弱相互作用和瞬时相互作用具有较高的灵敏度，能够捕捉到传统方法难以检测的短暂蛋白复合物。

 

4. 操作简便，性价比高

 

相比需要复杂仪器的FRET技术，BiFC只需常规荧光显微镜即可完成，实验成本低、操作流程简单。

5. 多物种适用的「通用工具」

BiFC技术已成功应用于拟南芥、水稻、烟草、玉米等多种植物，具有广泛的适用性。

BiFC技术的发展方向

1. 超高分辨率成像

结合超分辨显微镜技术（如STED、SIM），可以在纳米尺度上观察蛋白互作的精细结构。

 

2. 动态追踪技术

开发光激活型BiFC系统，实现对蛋白互作动态过程的实时追踪。

 

3. 高通量筛选平台

建立基于BiFC的高通量筛选体系，用于大规模鉴定蛋白互作网络或筛选调控蛋白互作的小分子化合物。

 

4. 多组学联合分析

将BiFC与转录组学、蛋白质组学、代谢组学相结合，深入解析蛋白互作在生物学过程中的调控机制。

BiFC技术凭借其独特的优势，已成为植物蛋白互作研究中不可或缺的工具。

从丛枝菌根共生到激素信号调控，再到自噬机制研究，BiFC技术不断推动着植物科学的发展。随着技术的不断创新和完善，BiFC将在未来的植物研究中发挥更加重要的作用，帮助我们揭开更多生命奥秘的面纱。

技术平台的完整性和实验体系的成熟度，往往决定了研究进度的快慢。武汉金开瑞生物工程有限公司深耕分子互作技术服务领域十余年，已建立覆盖双分子荧光互补（BiFC）、酵母双杂交（Y2H）、荧光素酶互补成像（Split-LUC/LCI）、双荧光素酶报告基因（Dual-LUC）、免疫共沉淀（Co-IP）、GST Pull-down、表面等离子体共振（SPR）、等温滴定量热法（ITC）、染色质免疫沉淀（ChIP）、电泳迁移率变动分析（EMSA）等十余种主流分子互作检测平台。从方案设计、载体构建到实验执行、数据分析，金开瑞提供全流程一站式技术服务，同时配套供应相关实验试剂盒，满足您从前期筛选到最终验证的全部需求。

 

参考文献：

[1] Ivanov S, Müller LM, Lefèvre FM, Harrison MJ. (2025). Yeast two-hybrid-sequencing and bifluorescence complementation resources for assessing protein–protein interactions in arbuscular mycorrhizal roots: CKL2 as a case study. New Phytologist, 249: 1592-1604.

[2] Yang MY, Tong AH, Wang L, Wu JS. (2025). Auxin-Induced Nicotine Inhibition Is Mediated by NaARF5 Through the Suppression of NaERF1-Like Expression and Interaction With NaERF1-Like in Nicotiana attenuata. Plant Biotechnology Journal, 24: 2642-2656.

[3] Ren HM, Ou QS, Pu Q, et al. (2024). Comprehensive Review on Bimolecular Fluorescence Complementation and Its Application in Deciphering Protein–Protein Interactions in Cell Signaling Pathways. Biomolecules, 14(7):859.

[4] Jung H, Ma W, Kim JH, Kwon C, Kang BH, Chung T. The SNARE protein SYP22 in Arabidopsis interacts with ATG8 to promote the autophagosome-vacuole fusion. Autophagy. 2026 Jul;22(7):1503-1517.