Foods | 黑果枸杞类外泌体提取工艺优化及其对HT22细胞中AB诱导的细胞凋亡和氧化应激的抑制作用

    近期发表在Foods期刊上的题为“Response Surface Methodology Optimization of Exosome-like Nanovesicles Extraction from Lycium ruthenicum  Murray and Their Inhibitory Effects on Aβ-Induced Apoptosis and Oxidative Stress in HT22 Cells”的文章，该研究聚焦药食同源植物黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murray, LRM）——其已知的抗氧化与神经保护活性为衍生ELNs（LRM-ELNs）的应用奠定基础，并针对阿尔茨海默病（AD）的核心病理β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积引发的线粒体凋亡和氧化应激损伤，提出创新性解决方案：通过聚乙二醇（PEG）沉淀法结合响应面优化技术，建立高效低成本的LRM-ELNs提取工艺，旨在阐明其在抑制Aβ诱导的神经元凋亡与氧化应激中的分子机制，为开发AD预防性膳食补充剂提供理论依据和技术支撑。

1、研究亮点

（1）优化ELN提取方法：通过PEG法优化LRM-ELN的提取条件，提高提取效率，为植物来源ELN的规模化生产提供了理论基础。

（2）揭示ELN的细胞保护作用：研究LRM-ELN对AD细胞模型的保护作用，为AD的治疗提供了新的思路。

（3）探索ELN的作用机制：深入探究LRM-ELN的作用机制，为开发新型AD治疗药物提供了理论依据。

 

2、研究思路

（1）使用单因素实验对LRM-ELN提取参数进行优化

    实验研究了PEG分子量、PEG浓度和离心力对LRM-ELNs产率、zeta电位和粒径的影响。结果显示，使用PEG6000时产率最高，粒径最小；PEG6000浓度为10%时，产率和粒径都达到最佳；离心力为8000×g时，产率最高且粒径适宜。

图1. 不同提取条件对LRM-ELNs的影响。( A ) LRM-ELNs在不同PEG分子量下的(a)产率、(b)zeta电位和(c)粒径。其他提取条件：PEG6000浓度为10%，相对离心力为8000×g，孵化时间为16小时。 ( B ) LRM-ELNs在不同PEG6000浓度下的(a)产率、(b)zeta 电位和(c)粒径。其他提取条件：孵化时间为16小时，相对离心力为8000×g。 ( C ) LRM-ELNs在不同相对离心力下的(a)产率、(b)zeta电位和(c)粒径。其他提取条件：PEG6000浓度为10%，孵化时间为16小时。 ( D ) LRM-ELNs在不同孵化时间下的(a)产率、(b)zeta电位和(c)粒径。其他提取条件：PEG6000浓度为10%，相对离心力为8000×g。数据以平均值±标准误表示。不同字母表示各组之间存在显著差异（p < 0.05）。

 

（2）使用响应面法（RSM）对LRM-ELN提取参数的优化

    基于单因素实验结果，研究人员确定了 PEG6000 浓度 (A)、相对离心力 (B) 和孵育时间 (C) 三个关键参数，并利用Box-Behnken设计 (BBD) 进行 RSM 分析。通过17 次实验，收集了不同参数组合下LRM-ELN的产率数据，并建立了非线性二次数学模型。模型分析结果显示，该模型具有很高的置信度和拟合度 (p-value <0.0001, R² =0.9856)，且参数之间相互作用显著，其中 PEG6000浓度对LRM-ELN产率的影响最大。通过分析响应面图，确定了 LRM-ELN提取的最佳参数组合为：PEG6000浓度11.93%，相对离心力9720×g，孵育时间21.12 小时，预测产率为4.19 g/kg。验证实验结果显示，在最佳条件下，LRM-ELN的实际产率为4.24 g/kg，与预测值非常接近，证明了 RSM优化方案的有效性。

图 2. 聚乙二醇6000浓度、相对离心力以及孵化时间对LRM-ELNs产率的三维（3D）响应面及其相应的二维（2D）等高线图。( A , D ) 聚乙二醇6000浓度与相对离心力， ( B , E ) 聚乙二醇6000浓度与时间， ( C , F ) 相对离心力与时间。

 

（3）LRM-ELNs的特征

    透射电子显微镜（TEM）被用于检测在优化条件下分离的LRM-ELNs的形态。如图3A所示，LRM-ELNs呈现出球形形状，代表了ELNs的典型特征。通过纳米粒子尺寸分析仪分析，显示LRM-ELNs的平均粒径为114.1纳米（图3B）。此外，LRM-ELNs的Zeta电位测量值为-6.36毫伏（图3C）。

图LRM-ELNs的特性：（A） 使用 TEM 观察 LRM-ELN。（B） LRM-ELN 的粒径。（C） LRM-ELN的Zeta电位。

 

（4）LRM-ELNs对Aβ诱导的HT22细胞凋亡的影响

    通过细胞实验发现，LRM-ELNs本身对HT22细胞没有毒性，而Aβ能够降低HT22细胞的活性并诱导细胞凋亡；LRM-ELNs能够有效抑制Aβ诱导的HT22细胞凋亡，并提高细胞活性。表明LRM-ELNs具有保护神经细胞免受Aβ伤害的潜力，为治疗阿尔茨海默病提供了新的希望。

图4. LRM-ELNs减轻了Aβ诱导的HT22细胞的细胞毒性和凋亡。通过MTT实验评估了（A）LRM-ELNs、（B）Aβ 和（C）LRM-ELNs/Aβ对HT22细胞存活率的影响。（D）通过流式细胞术评估了LRM-ELNs对Aβ诱导的HT22细胞凋亡的影响。数据以平均值±标准误表示。**与空白对照组相比，p<0.01；#与Aβ组相比，p<0.05；##与Aβ组相比，p<0.01。

 

（5）LRM-ELNs 对Aβ诱导的HT22细胞线粒体凋亡的影响

   研究发现Aβ能够降低HT22细胞的线粒体膜电位 (MMP)，增加促凋亡蛋白Bax的表达，减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并增加Cleaved Caspase-3的表达，从而诱导线粒体介导的细胞凋亡。LRM-ELNs能够提高Aβ处理的 HT22 细胞的MMP，减少Bax/Bcl-2比率，并降低Cleaved Caspase-3的表达，从而抑制线粒体介导的细胞凋亡。证明LRM-ELNs能够通过抑制线粒体凋亡途径来保护HT22细胞免受Aβ伤害。

图5. LRM-ELNs对Aβ诱导的HT22细胞线粒体凋亡途径的影响。（A）经Aβ处理的HT22细胞中MMP的变化，无论是否在不同浓度的LRM-ELNs作用下。（B-D）通过WB测定HT22细胞中Bax/Bcl2和 Cleaved Caspase-3的蛋白水平。 数据以平均值±标准误表示。** 与空白对照组相比，p < 0.01；与Aβ组相比，p < 0.01。

 

（6）LRM-ELNs对Aβ诱导的HT22细胞氧化应激的影响

    有研究已证实Aβ能够增加HT22细胞内活性氧 (ROS) 和丙二醛 (MDA) 的水平，并降低抗氧化酶（如SOD、CAT和GSH-Px）的活性。LRM-ELNs能够降低Aβ诱导的HT22细胞内ROS和MDA的水平，并提高抗氧化酶的活性。证明LRM-ELNs 能够有效抑制Aβ诱导的HT22细胞氧化应激，这为其在治疗阿尔茨海默病中的应用提供了理论依据。

图6. LRM-ELNs对HT22细胞抗氧化指标的影响。HT22细胞经Aβ处理，并分别用不同浓度的LRM-ELNs处理或不处理，检测以下指标的水平：（A，B）活性氧（ROS），（C）丙二醛（MDA），（D）过氧化氢酶（CAT），（E）超氧化物歧化酶（SOD），以及（F）谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。数据以平均值±标准误（SEM）表示。** 与空白对照组相比，p<0.01；p<0.05，##与Aβ组相比，p<0.01。

 

（7）LRM-ELNs对Aβ诱导的HT22细胞中Nrf2/HO-1/NQO1信号通路的影响

    实验结果表明，Aβ处理能够增加HT22细胞中细胞质Nrf2的表达，并降低细胞核Nrf2、HO-1和NQO1的表达。LRM-ELNs能够降低Aβ处理的HT22细胞中细胞质Nrf2的表达，并增加细胞核Nrf2、HO-1和NQO1的表达。证明LRM-ELNs能够激活Nrf2/HO-1/NQO1信号通路，从而提高抗氧化酶的表达，降低ROS和MDA的水平，并保护HT22细胞免受Aβ诱导的氧化应激。

图7. LRM-ELNs 对 Aβ 诱导的 HT22 细胞 Nrf2/HO-1/NQO1 信号通路的影响。（A-E）WB 测定 HT22 细胞中 nucl-Nrf2 、 cyto-Nrf2 、 HO-1 和 NQO1 的蛋白水平。数据表示为 SEM ±平均值。** p < 0.01 vs. 对照组，## p < 0.01 vs. Aβ 组。

 

3、研究结论

（1）PEG法能够有效地提取LRM-ELN，最佳提取条件为：PEG6000浓度11.93%，相对离心力9720×g，孵育时间21.12h。

（2）LRM-ELN能够抑制Aβ诱导的HT22细胞凋亡和氧化应激。

（3）LRM-ELN能够激活Nrf2/HO-1/NQO1信号通路，增强抗氧化酶活性，降低氧化应激水平，从而发挥细胞保护作用。

    总而言之，本文的研究为植物来源ELN的提取和应用提供了重要的理论依据，并为AD的治疗提供了新的思路和方法。未来研究可以进一步探索LRM-ELN的作用机制和应用价值，为开发新型AD治疗药物做出贡献。

 

参考文献：Response Surface Methodology Optimization of Exosome-like Nanovesicles Extraction from Lycium ruthenicum  Murray and Their Inhibitory Effects on Aβ-Induced Apoptosis and Oxidative Stress in HT22 Cells. Foods,2024.