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【周二晚上八点】金开瑞第二季分子互作主题直播首秀-免疫共沉淀技术(Co-IP)
文章来源:genecreate 作者:genecreate 发布时间:2020-10-19 10:33
        蛋白间相互作用是细胞各种基本功能的主要完成者,参与几乎所有的重要生命活动。因此,蛋白-蛋白相互作用研究以及建立相互作用的关系网络图,具有十分重要的意义,也是目前蛋白质研究领域的热点。
        Co-IP(免疫共沉淀,co-inmunoprecipitation)是经典的利用抗体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白、复合体的一项技术,能够特异性富集所研究的目的蛋白。由于过程中采用了非变性条件,保留了互作及复合体的细胞内状态。相对于酵母双杂交、pull down等方法,其特色之一便是捕获的蛋白互作发生在所研究的特定组织细胞内,保存了互作蛋白及复合体的“内源”状态。
Co-IP实验原理
        以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
        当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
 Co-IP实验优势
a)   取材可以选择该目的蛋白所在物种、特定组织、细胞,因此CoIP能够反应该蛋白在天然组织细胞状态下存在的互作关系蛋白;
b)   找出整个复合体中直接/间接互作的多个蛋白,研究复合体组成;
c)   通过与质谱鉴定连用可以初筛到一系列未知蛋白,再通过其他技术进一步验证。
 Co-IP实验注意事项
a)需要特异性IP级别诱饵蛋白抗体(重点);
b)如果没有特异性抗体,则需要考虑构建重组标签质粒,用标签抗体进行CoIP实验;
c)样品种类实验风险:过表达细胞样品<细胞样品<动物组织样品<植物样品(通常为转基因植物,标签抗体也很难达到特异性富集);
d)CoIP-MS风险:由于存在特异性抗体高丰度蛋白,质谱不一定能够鉴定到诱饵蛋白。
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