TA克隆原理及实验步骤
TA克隆(T-vector cloning)是常用的DNA片段克隆方法,它利用了T限制性内切酶切割DNA的特点进行片段插入。以下是TA克隆的原理和实验步骤:
TA克隆原理:
首先,使用T限制性内切酶对待克隆的DNA片段进行酶切。T限制性内切酶通常识别并切割具有T/A碱基序列的DNA。
利用聚合酶在酶切后的DNA片段末端加上额外的腺嘌呤(A)碱基,形成与切割末端互补的单链悬臂。
使用线性化的载体DNA,该载体带有相应的T限制性内切酶切位点。载体和DNA片段的粘性末端具有互补性。
将T限制性内切酶切割后的DNA片段与线性化的载体DNA混合,使互补的末端结合。
利用DNA连接酶催化反应将DNA片段连接到载体DNA上,形成重组的载体-片段融合DNA。
将重组的载体DNA转化到宿主细胞中,如大肠杆菌细胞。转化后的细胞在含有适当抗生素的选择性培养基上进行培养。
通过筛选或测序等方法,确认是否成功插入目标DNA片段,并从正面克隆中分离纯化融合的载体。
TA克隆实验步骤:
获得目标DNA片段,可以通过PCR扩增或其他方法获得。
使用T限制性内切酶对目标DNA片段进行酶切。
在切割末端加上额外的腺嘌呤(A)碱基,通常使用聚合酶的模板无参与扩增方法。
线性化载体DNA,使其具有互补的粘性末端。
将DNA片段和线性化载体DNA混合,在合适的缓冲液中进行连接酶催化反应。
将重组的载体DNA转化到宿主细胞中,如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的选择性培养基上孵育转化后的细胞。
进行筛选或测序,确认是否成功插入目标DNA片段,并提取纯化融合的载体DNA。
通过以上步骤,可以实现TA克隆,将目标DNA片段插入到载体DNA中,进而进行蛋白表达、基因功能研究等应用。
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