组织样本提取外泌体前需要进行哪些预处理？

    外泌体作为细胞分泌的纳米级囊泡，其提取质量受样本预处理环节的直接影响。相较于体液样本，组织样本因含有复杂的细胞外基质、细胞碎片及蛋白质复合物，预处理步骤更为繁琐。以下从样本采集、保存、破碎、杂质清除到样本优化等环节，系统阐述组织样本提取外泌体前的预处理流程及关键技术要点。

一、组织样本的采集与初始保存

1. 样本采集的时效性与无菌原则

    采集时机：组织样本需在离体后尽快处理，若无法立即进行预处理，需在 30 分钟内完成初步固定。例如，肿瘤组织取样时，应避免长时间暴露于室温，以防细胞自溶导致外泌体释放紊乱或降解。

    无菌操作：使用无菌手术刀或剪刀切割目标组织，避免接触污染物（如手套粉末、器械油污），采集后立即置于无菌培养皿或 EP 管中。对于动物实验样本，需在安乐死后迅速解剖取材，减少缺血缺氧对细胞外泌体分泌的影响。

2. 样本保存的标准化方法

    短期保存（<24 小时）：

        置于 4℃含蛋白酶抑制剂的 PBS（磷酸盐缓冲液）中，可添加 1% 双抗（青霉素 - 链霉素）防止细菌污染。

        示例：脑组织样本可切割为 1cm³ 小块，浸没于预冷的 PBS 中，4℃保存不超过 12 小时，避免反复冻融。

    长期保存（>24 小时）：

        快速冷冻法：用预冷的 OCT（ optimal cutting temperature compound）包埋后，立即投入液氮速冻，转移至 - 80℃冰箱保存，可维持外泌体结构稳定 6 个月以上。

        保存液优化：若需长期保存且后续需提取 RNA，可使用 RNA Later 等专用保存液，抑制 RNA 酶活性的同时减少外泌体破裂。

二、组织样本的破碎与匀浆处理

1. 组织破碎的核心技术选择

    机械匀浆法：

        适用场景：适用于质地较软的组织（如肝脏、脾脏），常用仪器包括组织捣碎机、玻璃匀浆器。

        操作要点：将组织剪碎至 1-2mm³ 小块，按 1:5-1:10（g:mL）比例加入预冷的匀浆缓冲液（含 PBS、蛋白酶抑制剂），在冰浴中以 1000-2000rpm 匀浆 3-5 次，每次 10-15 秒，避免产热导致外泌体蛋白变性。

    超声破碎法：

        适用场景：适用于纤维成分较多的组织（如肿瘤、肌肉），利用超声波的空化效应破坏细胞外基质。

        操作要点：设置超声功率 200-300W，脉冲模式（工作 3 秒，间隔 5 秒），总时间不超过 2 分钟，全程冰浴冷却，防止局部过热破坏外泌体膜结构。

    酶消化法：

        适用场景：适用于需保留外泌体膜蛋白活性的场景，常用酶包括胶原酶、透明质酸酶。

        操作要点：将组织剪成碎块后，加入 0.1-0.2mg/mL 胶原酶 Ⅰ，37℃振荡消化 30-60 分钟，消化后需立即加入蛋白酶抑制剂终止反应，避免酶对外泌体表面蛋白的降解。

2. 匀浆缓冲液的优化配置

    基础成分：PBS（pH 7.4）、1-2mM EDTA（螯合金属离子，抑制蛋白酶）、1× 蛋白酶抑制剂鸡尾酒（如 Roche Complete 抑制剂）。

    特殊添加剂：若样本含大量红细胞（如肝脏），可添加 0.83% 氯化铵溶液裂解红细胞，减少血红蛋白对后续提取的干扰。

 

三、细胞与大颗粒杂质的清除

1. 多级离心法分离细胞碎片

    低速离心（第一步）：

        4℃下 1000-2000×g 离心 10-15 分钟，去除未破碎的细胞、组织块及大颗粒杂质，取上清转移至新管。

        注意：离心后需小心吸取上清，避免吸到底部沉淀，可预留 10% 上清液防止杂质混入。

    中速离心（第二步）：

        4℃下 10,000-15,000×g 离心 20-30 分钟，去除细胞碎片、凋亡小体等较大囊泡，此时上清液为初步纯化的组织匀浆裂解液。

2. 过滤辅助清除微杂质

    孔径选择：使用 0.45μm 或 0.22μm 无菌滤膜过滤离心后的上清液，去除残留的细胞碎片或纤维蛋白，避免堵塞后续提取步骤中的膜组件（如超滤管）。

    操作注意：过滤时避免用力挤压，可采用负压抽滤或重力过滤，防止剪切力破坏外泌体结构。

 

四、蛋白质与核酸杂质的特异性清除

1. 蛋白质杂质的处理策略

    沉淀法减少蛋白浓度：

        向预处理后的样本中加入 10% 体积的冷丙酮，-20℃沉淀 2 小时，4℃下 12,000×g 离心 15 分钟，去除可溶性蛋白（如白蛋白、球蛋白）。

        或使用硫酸铵分级沉淀法，通过调节盐浓度选择性沉淀高丰度蛋白，但需注意盐离子残留可能影响后续外泌体分离。

    蛋白酶处理：

        若需保留外泌体膜蛋白，避免使用蛋白酶；若仅提取外泌体 RNA，可加入 100μg/mL RNase-free DNase 和 50μg/mL 蛋白酶 K，37℃孵育 30 分钟降解核酸和游离蛋白，但需控制酶浓度以防外泌体膜蛋白被破坏。

2. 核酸杂质的清除

    核酸酶消化：加入 10-20U/mL RNase A 和 2U/mL DNase I，37℃孵育 15-20 分钟，降解样本中的游离 DNA 和 RNA，减少后续提取中外泌体与核酸的共沉淀。

 

五、样本体积与成分的优化

1. 样本浓缩与缓冲液置换

    超滤浓缩：使用 100kDa 分子量截留的超滤管（如 Amicon Ultra），4℃下 3000×g 离心 15-20 分钟，将样本体积浓缩至原体积的 1/10-1/5，同时用 PBS 置换缓冲液，降低盐离子或消化酶残留。

    注意事项：超滤前需确保样本无杂质，避免堵塞滤膜；离心后需用 PBS 反洗滤膜，回收截留的外泌体。

2. pH 与离子浓度调节

    若样本经酶消化后 pH 偏低，可用 1M Tris-HCl（pH 8.0）调节至中性（pH 7.2-7.4），防止酸性环境导致外泌体聚集或膜蛋白变性。

 

六、特殊组织类型的预处理优化

1. 肿瘤组织的预处理要点

    血管与间质清除：肿瘤组织常含大量血管，可在匀浆前用 PBS 反复冲洗，去除血液成分；若需分离肿瘤细胞来源的外泌体，可先通过免疫磁珠法去除血管内皮细胞，减少非肿瘤细胞外泌体的污染。

2. 纤维化组织（如肝脏、肺纤维化）

    增加酶消化时间至 45-60 分钟，使用胶原酶 Ⅱ 与透明质酸酶（1:1）混合消化液，破坏纤维化基质，提高细胞外泌体的释放效率。

3. 脑组织的预处理注意

    脑组织富含脂质，匀浆时需加入 0.1% Triton X-100（非离子型去垢剂）溶解脂质，但需控制浓度，避免破坏外泌体膜；同时，低速离心速度降至 800×g，防止神经外泌体因密度较低而被沉淀去除。

 

七、预处理质量控制与污染防控

1. 污染防控措施

    耗材与试剂要求：使用无 RNA 酶 / DNA 酶、无热源的 EP 管和移液枪头，所有缓冲液需经 0.22μm 滤膜过滤，避免环境中的外泌体样颗粒（如塑料微粒）污染。

    操作人员防护：佩戴无菌手套，避免皮肤接触样本，操作台面用 75% 乙醇消毒，减少指纹、汗液中的外泌体污染。

2. 预处理效果评估

    蛋白浓度测定：采用 BCA 法或 Bradford 法测定预处理后样本的蛋白浓度，若蛋白浓度 > 5mg/mL，需适当稀释或浓缩，确保后续外泌体提取效率。
    显微镜观察：取少量预处理后的样本，经 0.22μm 滤膜过滤后，用相差显微镜观察，确认无明显细胞碎片或大颗粒杂质，若杂质较多需重复离心或过滤步骤。

 

八、预处理流程的标准化与常见问题解决方案

问题	可能原因	解决方案
匀浆后样本黏度高	核酸或多糖残留	加入核酸酶消化，或用氯仿 - 异戊醇（24:1）抽提去除多糖
离心后上清浑浊	细胞破碎不充分或杂质未除尽	增加匀浆次数或提高离心速度，重复低速 - 中速离心步骤
外泌体产量低	保存不当或预处理步骤破坏外泌体	优化保存条件，避免反复冻融；调整匀浆强度，减少超声时间或降低酶浓度

    组织样本外泌体提取的预处理是一个多环节协同的过程，从样本采集的时效性到匀浆、离心、杂质清除的精细化操作，每一步均需基于组织类型和实验目的进行优化。标准化的预处理流程不仅能提高外泌体的产量与纯度，还能减少实验误差，为后续的外泌体鉴定（如电镜、WB）和功能研究奠定基础。随着外泌体研究的深入，新型预处理技术（如微流控芯片辅助分离、亲和层析预处理）也在不断发展，需根据实验需求选择最合适的方案。