BiFC实验的阳性对照质粒

    在双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）实验中，阳性对照质粒的作用是验证整个实验体系是否能够正常工作，即当两个已知可以相互作用的蛋白分别与荧光蛋白的N端和C端片段融合表达时，能否成功重建荧光信号。常见的BiFC阳性对照质粒组合包括：

 

1. 基于转录因子相互作用的对照

    bZIP 蛋白对：如 Jun/Fos（也称为 c-Jun/c-Fos）

        这是一对经典的亮氨酸拉链（leucine zipper）转录因子，具有强而稳定的相互作用。

        在BiFC实验中，常将c-Jun与YFP的N端（如YN或Vn）融合，c-Fos与YFP的C端（如YC或Vc）融合。

        表达后可在细胞核中观察到明显的黄色荧光（YFP信号）。

 

2. 基于泛素系统的对照（较少用于BiFC，更多用于酵母双杂交）

    不太常用，但在某些定制系统中可能使用。

3. 商业化BiFC试剂盒中的阳性对照

许多公司提供标准化的BiFC阳性对照质粒。例如：

    Addgene #22010 和 #22011：

        pBiFC-VN173（含YFP N端1-173 aa，常与目标蛋白N端融合）

        pBiFC-bJun-VC155（含bJun-YFP C端155-239 aa）

        pBiFC-bFos-VC155（含bFos-YFP C端）

        共转染 pBiFC-bJun-VC155 + pBiFC-bFos-VN173 可作为阳性对照

    注意：具体载体编号和构建方式可能因实验室或供应商不同而略有差异。

 

构建阳性对照时的注意事项：

    确保两个融合蛋白的表达水平相当；

    荧光蛋白片段（如YFP的N端/ C端）不应自发重组（即阴性对照应无荧光）；

    阳性对照应在预期亚细胞定位（如Jun/Fos在细胞核）发出荧光；

    使用同一启动子（如CMV）驱动两个融合蛋白，以保证表达一致性。

 

推荐做法：

如果你正在设计BiFC实验，建议：

    从Addgene等公共质粒库获取已验证的阳性对照质粒（如Jun/Fos-YFP BiFC系统）；

    同时设置阴性对照（如一个融合蛋白 + 空载体，或使用突变体不能互作的蛋白对）；

    在相同条件下进行共聚焦显微镜观察或流式细胞术检测荧光信号。