酵母双杂交实验结果通常通过哪些直观的现象或指标来判断蛋白质间是否存在相互作用？

一、酵母双杂交系统的基本原理

    酵母双杂交系统基于转录因子的模块化结构，典型如 GAL4 蛋白可分为 DNA 结合域（BD）和转录激活域（AD）。当待研究的两种蛋白质（诱饵蛋白与猎物蛋白）分别与 BD 和 AD 融合后，若两者存在相互作用，可使 BD 与 AD 在空间上接近，重新构建具有活性的转录因子，进而激活报告基因的表达。因此，报告基因的表达状态是判断蛋白质互作的核心依据，其表达产物可通过多种直观现象或量化指标呈现。

 

二、基于报告基因表达的直观判断指标

（一）营养缺陷型培养基上的菌落生长

1. 原理

    酵母双杂交系统常用的报告基因包括组氨酸（HIS3）、亮氨酸（LEU2）、色氨酸（TRP1）等营养缺陷型基因。当 BD 与 AD 因蛋白质互作而结合时，报告基因被激活，酵母可在缺乏对应氨基酸的培养基上生长；若无互作，报告基因不表达，酵母无法在缺陷型培养基上存活。

2. 直观现象

    筛选培养基：常见为 SD/-Trp/-Leu（筛选转化子）、SD/-Trp/-Leu/-His（筛选互作阳性）、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（严格筛选）。

    阳性结果：在 SD/-His 或 SD/-His/-Ade 培养基上出现肉眼可见的菌落，且菌落大小与互作强度正相关（强互作菌落较大、生长较快）。

   对照设置：需设置阳性对照（如已知互作蛋白的质粒组合）和阴性对照（如空载体 BD 与 AD 组合），排除自激活或背景生长。

3. 注意事项

    部分弱互作可能导致菌落生长缓慢，需延长培养时间（3-5 天）观察。

    培养基中可添加 3 - 氨基三唑（3-AT）抑制背景生长，提高筛选特异性。

 

（二）颜色反应检测

1. β- 半乳糖苷酶（LacZ）报告基因

    原理：LacZ 基因表达产物可催化 X-gal（5 - 溴 - 4 - 氯 - 3 - 吲哚 -β-D - 半乳糖苷）水解，生成蓝色产物。

    直观现象：

        滤膜显色法：将酵母菌落转移至滤膜，经液氮冻融破菌后，浸泡于含 X-gal 的缓冲液中，阳性菌落所在位置在 1-4 小时内变蓝（图 1）。

        平板显色法：在培养基中添加 X-gal，阳性菌落直接呈现蓝色，阴性菌落为白色或浅黄色。

    量化应用：可通过测定 β- 半乳糖苷酶的酶活（如 ONPG 作为底物，测定 420nm 吸光度），评估互作强度（酶活越高，互作越强）。

2. 其他颜色报告基因

    Aureobasidin A（AbA）抗性基因：虽非显色基因，但可通过在含 AbA 的培养基上生长判断阳性，常用于排除自激活。

    GUS（β- 葡萄糖醛酸酶）基因：催化底物 X-Gluc 生成蓝色产物，原理与 LacZ 类似，但在酵母双杂交中较少使用。

（三）荧光蛋白表达检测

1. 原理

    将荧光蛋白基因（如 GFP、YFP、mCherry）与报告基因启动子偶联，当蛋白质互作激活转录时，荧光蛋白表达，可通过荧光显微镜或流式细胞仪观察。

2. 直观现象

    细胞荧光信号：阳性酵母细胞呈现绿色（GFP）、黄色（YFP）或红色（mCherry）荧光，且荧光强度与互作效率正相关（图 2）。

    亚细胞定位：若荧光蛋白分布于细胞核（如 GAL4 系统激活核内报告基因），可进一步佐证互作发生在核内。

3. 优势

    可实时动态监测互作，避免破坏细胞结构。

    适用于高通量筛选，通过流式细胞仪分选出高荧光强度的细胞。

 

（四） Luciferase（荧光素酶）报告基因检测

1. 原理

    荧光素酶可催化荧光素氧化并释放光子，通过 luminometer（发光检测仪）测定光信号强度，反映报告基因表达水平。常用报告基因包括萤火虫荧光素酶（Luc）和海肾荧光素酶（Renilla Luc），后者常作为内参校正转染效率。

2. 量化指标

    发光值（RLU，相对光单位）：RLU 越高，表明蛋白质互作越强。
    Luc/Renilla 比值：通过双荧光素酶检测系统校正背景，提高数据可靠性。

3. 应用场景

    适用于定量分析互作强度，尤其在药物筛选或突变体功能研究中。

    可检测瞬时或弱互作，灵敏度高于颜色反应。

 

三、辅助判断指标与结果验证

（一）蛋白表达水平验证

1. Western blot 检测

    通过抗 BD 或抗 AD 标签的抗体，检测诱饵蛋白（BD 融合蛋白）和猎物蛋白（AD 融合蛋白）的表达量。若互作阴性但蛋白未表达，可能导致假阴性结果。

2. 亚细胞定位分析

    利用荧光蛋白融合标签（如 GFP-BD 或 AD-mCherry），通过共聚焦显微镜观察蛋白是否共定位于细胞核，排除因蛋白定位差异导致的假阴性。

 

（二）排除假阳性与假阴性

1. 假阳性（误判互作存在）

    原因：诱饵蛋白自激活 AD（如 BD - 诱饵蛋白单独激活报告基因）、非特异性蛋白结合。

    验证方法：

        单转实验：仅转化 BD - 诱饵蛋白，检测是否在缺陷型培养基生长或显色，排除自激活。

        点突变实验：突变诱饵蛋白的关键结构域，若互作消失，证明特异性。

2. 假阴性（漏判互作存在）

    原因：蛋白表达量低、互作依赖翻译后修饰（如磷酸化）、亚细胞定位错误。

    优化策略：

        更换酵母菌株（如 AH109、Y2HGold），部分菌株含多个报告基因，提高灵敏度。

        加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解；或使用诱导型启动子（如 GAL1）增强蛋白表达。

 

（三）互作强度的量化分析

1. 菌落生长速度与大小

    在缺陷型培养基上，阳性菌落的生长速率（如每天直径增加量）可半定量反映互作强度。

2. 酶活或荧光强度的梯度变化

    通过稀释酵母悬液并测定不同浓度下的 β- 半乳糖苷酶活性或荧光值，建立剂量 - 反应曲线，比较不同蛋白组合的互作效率。

3. 竞争性实验

    加入互作抑制剂（如抗体或小分子化合物）后，若报告基因表达量下降，可佐证互作的特异性。

 

四、不同检测指标的对比与选择

指标类型	直观性	定量能力	灵敏度	操作复杂度	适用场景
营养缺陷型生长	★★★★☆	★★☆☆☆	★★★☆☆	★☆☆☆☆	初筛、高通量筛选
LacZ 颜色反应	★★★★☆	★★★☆☆	★★★☆☆	★★☆☆☆	可视化验证、定性分析
荧光蛋白表达	★★★☆☆	★★★★☆	★★★★☆	★★★☆☆	亚细胞定位、动态监测
荧光素酶报告基因	★★☆☆☆	★★★★★	★★★★★	★★★★☆	定量分析、弱互作检测
Western blot	★☆☆☆☆	★★★☆☆	★★★☆☆	★★★★☆	蛋白表达验证、假阴性排除

五、实验案例与结果解读

案例：诱饵蛋白 A 与猎物蛋白 B 的互作验证

    营养缺陷型筛选：在 SD/-Trp/-Leu/-His 培养基上，A+BD 与 B+AD 共转化的酵母出现菌落，而阴性对照（BD 空载体 + AD-B）无生长，初步提示互作存在。

    LacZ 滤膜显色：阳性菌落变蓝，阴性对照不变色，进一步确认互作。

    荧光素酶检测：A-B 互作组的 Luc/Renilla 比值为 12.5，显著高于阴性对照（1.2），表明强互作。

    Western blot：检测到 BD-A 和 AD-B 蛋白均正常表达，排除因蛋白不表达导致的假阴性。

    酵母双杂交实验中，蛋白质互作的判断需结合多种指标：营养缺陷型生长是初筛的核心方法，颜色反应与荧光检测提供可视化证据，而荧光素酶报告基因和蛋白表达验证则用于定量分析与结果确证。为避免假阳性或假阴性，需严格设置对照实验，并通过多维度指标交叉验证。随着技术发展，荧光蛋白标记与单细胞分析技术的结合，正逐步提升互作检测的灵敏度与空间分辨率。