外泌体鉴定的金标准方法有哪些？怎么操作？

一、外泌体鉴定的背景与意义

    外泌体作为直径 30-150nm 的膜性囊泡，参与细胞间通讯、免疫调节及疾病进展等重要生理病理过程。由于其与其他细胞外囊泡（如微囊泡、凋亡小体）在大小和组成上存在重叠，精准鉴定外泌体需结合多维度标准。目前，国际外泌体协会（ISEV）推荐的金标准方法主要涵盖形态学观察、粒径与浓度分析、标志性分子检测三大维度，三者联合使用可有效排除其他囊泡干扰，确保鉴定结果的可靠性。

二、形态学鉴定金标准：透射电子显微镜（TEM）

1、原理与应用

    TEM 通过电子束穿透样品形成高分辨率图像，可直接观察外泌体的典型杯状或茶托状结构，这是其区别于其他囊泡的特征性形态。该方法分辨率可达 0.1nm，能清晰显示外泌体双层膜结构，是形态学鉴定的 “金标准”。

2、操作流程

（1）样品制备

    取 100μL 外泌体悬液（浓度≥1×10^9 particles/mL），滴加至碳膜覆盖的铜网上，室温静置 10 分钟。

    用滤纸吸去多余液体，滴加 2% 磷钨酸（pH 7.0）负染 1-2 分钟，再次吸干后自然晾干。

（2）电镜观察

    将铜网装入样品台，置于 TEM 中，加速电压设置为 80-120kV。

    从低倍镜（×5,000）开始扫描，定位后切换至高倍镜（×50,000-×100,000）观察，拍摄至少 20 张代表性图片。

（3）结果分析

    统计图片中外泌体的形态特征：直径 30-150nm，双层膜，典型杯状结构。

    注意与蛋白质聚集体（无膜结构）、微囊泡（直径＞150nm，表面较平整）的区分。

3、注意事项

    负染时间过长易导致膜结构模糊，过短则对比度不足。

    样品浓度过高会引起外泌体重叠，需提前优化稀释倍数。

    冷冻电镜（Cryo-EM）可避免化学染色对结构的影响，适用于高分辨率分析，但设备成本较高。

 

三、粒径与浓度分析金标准：纳米颗粒跟踪分析（NTA）

1、原理与应用

    NTA 基于光散射和布朗运动原理，通过激光照射样品，追踪单个颗粒的运动轨迹，计算其扩散系数并转换为粒径分布，同时统计颗粒浓度。该方法可实时监测外泌体的粒径范围（30-150nm）和数量浓度，是量化分析的核心技术。

 

2、操作流程

（1）样品预处理

    用 0.22μm 滤膜过滤 PBS 缓冲液，作为稀释剂。

    将外泌体样品用滤过的 PBS 稀释至 1×10^8-1×10^9 particles/mL（避免颗粒聚集）。

（2）仪器设置与测量

    打开 NTA 仪器（如 NanoSight LM10），预热激光和摄像头 15 分钟。

    吸取 1mL 稀释样品注入样品池，设置参数：

    激光功率：60-80%（根据样品浊度调整）；

    拍摄时间：每样本采集 3 次，每次 60 秒；

    温度控制：25℃（避免温度波动影响布朗运动）。

（3）数据分析

    使用 NTA 配套软件（如 NanoSight NTA 3.3）处理数据：

    手动调整检测阈值（Threshold）和最小光强（Min Brightness），排除背景噪声；

    生成粒径分布直方图（主峰应在 30-150nm）和浓度统计结果。

 

3、注意事项

    样品中若含细胞碎片或蛋白质聚集体，需通过超速离心（100,000×g，2 小时）或 0.22μm 超滤去除。

    激光功率过高会导致光漂白，过低则信号不足，需根据样品浓度优化。

    对比法：若 NTA 测得的粒径主峰＞150nm，需考虑是否为微囊泡污染。

 

四、标志性分子检测金标准：Western Blot 与流式细胞术

1、Western Blot（WB）检测膜蛋白标志物

（1）原理与应用

    WB 通过特异性抗体识别外泌体表面的标志性蛋白，如四次跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）、热休克蛋白（HSP70、HSP90），同时排除细胞蛋白污染（如内质网蛋白 Calnexin、核蛋白 Lamin B）。该方法是分子水平鉴定外泌体的 “金标准”。

（2）操作流程

    样品制备：取 50-100μg 外泌体蛋白（通过 BCA 法定量），加入 SDS 上样缓冲液，95℃煮沸 5 分钟。

    电泳与转膜：10-12% SDS-PAGE 凝胶电泳（80V，30 分钟；120V，60 分钟），湿转法将蛋白转移至 PVDF 膜（250mA，90 分钟）。

（3）免疫杂交：

    5% 脱脂奶粉封闭 1 小时；

    一抗孵育：CD9（1:1000）、CD63（1:1000）、Calnexin（1:2000）4℃过夜；

    HRP 标记二抗（1:5000）室温孵育 1 小时；

    ECL 化学发光显影，曝光时间 5-30 秒。

 

2、结果判断

    阳性结果：CD9、CD63 等条带清晰，Calnexin 无条带（提示无细胞污染）。

    阴性对照：使用 PBS 代替样品，排除抗体非特异性结合。

 

2、流式细胞术（Flow Cytometry）检测表面标志物

（1）原理与应用

    流式细胞术通过荧光标记抗体定量分析外泌体表面标志物（如 CD63-PE、CD81-FITC），并结合粒径前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数，实现高通量、单细胞水平的标志物检测。

（2）操作流程

    样品预处理：外泌体浓度调整至 1×10^9 particles/mL，用 0.22μm 滤膜过滤去除聚集体。

    抗体标记：取 100μL 样品，加入 10μL 荧光标记抗体（如 CD63-PE），避光孵育 30 分钟。

（3）流式检测：

    仪器：配备 488nm 激光的流式细胞仪（如 BD FACSCalibur）；

    检测参数：FSC（线性，10^3-10^5），SSC（对数），PE 荧光通道（575/26nm）；

    补偿设置：用单染样品校准荧光通道交叉干扰。

（4）数据分析

    设门策略：先通过 FSC-SSC 排除背景噪声，圈定 30-150nm 颗粒区域，再分析荧光阳性率（图 4）。
    阳性标准：CD63 等标志物阳性率＞80%，同时阴性对照（IgG 同型抗体）阳性率＜5%。

 

3、注意事项

    WB 中抗体的特异性至关重要，建议使用商业化验证抗体（如 Abcam、BD Biosciences）。

    流式细胞术检测外泌体时，因颗粒过小（＜200nm），需优化仪器阈值，避免漏检。

    组织来源外泌体可能表达特异性标志物（如肿瘤外泌体表达 EpCAM），需结合研究背景选择抗体组合。

 

五、新兴鉴定方法与技术拓展

1、原子力显微镜（AFM）

    AFM 通过探针扫描样品表面，获取外泌体的三维结构与表面形貌，分辨率可达纳米级，可观察膜表面蛋白突起（如 CD63 簇），但操作流程复杂，多用于机制研究。

2、冷冻蚀刻电镜（Freeze-Etching EM）

    该技术通过冷冻断裂样品，暴露膜内部结构，可观察外泌体膜上的蛋白质颗粒（如四次跨膜蛋白复合体），是 TEM 的补充方法，适用于膜蛋白定位分析。

3、质谱（MS）分析

    质谱可高通量鉴定外泌体蛋白组成，通过与数据库（如 ExoCarta）比对，确认外泌体特征性蛋白（如≥3 种四次跨膜蛋白），并发现新型标志物，但无法直接提供形态和粒径信息。

 

六、多维度联合鉴定策略与标准流程

1、ISEV 推荐的 “3M” 鉴定标准

    Morphology（形态学）：TEM 观察到典型杯状结构，直径 30-150nm；
    Size（尺寸）：NTA 显示粒径主峰在 30-150nm，浓度≥1×10^9 particles/mL；

    Markers（标志物）：WB 或流式检测到 CD9/CD63/CD81 阳性，细胞蛋白（如 Calnexin）阴性。

2、实验流程建议

    初步筛选：NTA 检测粒径分布与浓度，排除大颗粒污染；

    形态确认：TEM 观察典型结构，排除蛋白质聚集体；

    分子验证：WB 或流式检测标志物表达，确认外泌体来源；

    质量控制：每批次实验设置阳性对照（如已知外泌体样品）和阴性对照（无细胞培养基）。

 

七、常见问题与解决方案

问题类型	可能原因	解决方案
TEM 图像中无典型杯状结构	1. 样品中含微囊泡； 2. 负染过度	1. 增加超速离心步骤（100,000×g，2 次）； 2. 优化负染时间至 1 分钟
NTA 粒径主峰＞150nm	微囊泡或细胞碎片污染	1. 样品通过 0.22μm 超滤膜； 2. 采用密度梯度离心（如蔗糖 / 碘克沙醇梯度）
WB 标志物条带弱	1. 抗体效价低； 2. 外泌体蛋白浓度不足	1. 更换高亲和力抗体； 2. 增加上样量至 100μg，或使用浓缩柱富集
流式检测信号弱	外泌体表面标志物密度低	1. 采用链霉亲和素 - 生物素放大系统； 2. 优化抗体孵育时间至 45 分钟

 

    外泌体的精准鉴定依赖于形态学、尺寸分布、分子标志物的多维度联合分析，TEM、NTA 和 WB / 流式细胞术构成了当前鉴定体系的金标准。随着技术发展，冷冻电镜、单细胞质谱等新兴方法正逐步融入鉴定流程，未来有望建立更高效、自动化的外泌体鉴定平台。在实验中，研究者需根据样本类型（如体液、细胞培养上清）和研究目的，合理组合鉴定方法，严格控制实验误差，以确保外泌体研究数据的可靠性。