以细菌致病机制研究为例，如何利用酵母双杂交技术筛选与细菌毒力相关的蛋白质相互作用？

    在细菌致病机制研究中，酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）技术是筛选蛋白质相互作用的经典工具，尤其适用于挖掘细菌毒力因子（如黏附素、毒素、分泌系统效应蛋白等）与细菌自身调控蛋白、或与宿主靶蛋白之间的相互作用，从而揭示毒力表达调控、宿主入侵/免疫逃逸等关键机制。以下结合细菌致病研究的特点，详细说明其应用流程：

一、酵母双杂交技术的核心原理
    酵母双杂交系统基于真核转录因子的结构域分离特性（如GAL4系统）：

    转录因子分为DNA结合域（BD） 和转录激活域（AD），单独的 BD 可结合启动子但无法激活转录，单独的 AD 无结合能力；

    若将 “诱饵蛋白（X）” 与 BD 融合（BD-X），“猎物蛋白（Y）” 与 AD 融合（AD-Y），当 X 与 Y 发生相互作用时，BD与 AD会在细胞核内靠近，形成功能性转录因子，激活下游报告基因（如His3、LacZ、Ade2等）的表达，通过酵母生长表型或显色反应筛选阳性克隆。

 

二、以细菌致病机制研究为例的具体应用步骤

1、明确研究目标：确定 “诱饵蛋白” 的选择

    在细菌致病机制中，诱饵蛋白通常选择已知或候选的细菌毒力相关蛋白，需根据研究方向聚焦：

    方向 1：探索细菌毒力因子的自身调控网络（如毒力因子与细菌内调控蛋白的相互作用）：诱饵可选细菌毒力因子（如外毒素、Ⅲ 型分泌系统效应蛋白）或毒力调控因子（如毒力相关转录因子）；

    方向 2：解析细菌与宿主的相互作用（如细菌如何通过蛋白互作入侵宿主、抑制免疫）：诱饵可选细菌分泌的毒力因子（如黏附素、侵袭素），猎物则为宿主细胞（如上皮细胞、免疫细胞）的蛋白。

 

2、诱饵蛋白的载体构建与验证

（1）诱饵基因的克隆

        从细菌基因组中扩增目标毒力蛋白的编码基因（如virF、intimin等），需排除信号肽（若为分泌蛋白）或跨膜区（若为膜蛋白，避免影响核内定位），仅保留可能参与互作的结构域（提高筛选效率）。

        将基因插入酵母双杂交BD载体（如pGBKT7），构建重组载体BD-诱饵（确保读码框正确，避免移码突变）。

 

（2）诱饵蛋白的自激活与毒性检测

        将BD-诱饵载体转化至缺陷型酵母菌株（如Y2HGold），同时转化空BD载体（阴性对照）和已知自激活的载体（阳性对照）。

        观察酵母在营养缺陷培养基（如SD/-Trp/-His/-Ade）上的生长情况及显色反应（如X-α-Gal显色）：

            若BD-诱饵单独使酵母在缺陷培养基上生长或显色，说明存在自激活（需截断诱饵蛋白或更换载体）；

            若酵母生长明显弱于空载体组，说明诱饵蛋白对酵母有毒性（需降低表达量，如更换弱启动子）。

 

3、猎物文库的构建或选择

    猎物文库需根据研究目标确定来源，核心是覆盖可能与诱饵蛋白互作的蛋白：

（1）细菌自身蛋白文库（研究毒力因子的细菌内调控网络）

        提取细菌总RNA，反转录为cDNA，通过随机引物扩增获得全基因组范围的cDNA片段；

        将cDNA插入AD载体（如pGADT7），构建细菌cDNA文库（需保证文库覆盖率和完整性，避免遗漏低丰度蛋白）。

 

（2）宿主细胞蛋白文库（研究细菌与宿主的互作，如入侵、免疫逃逸）

        选择细菌感染的靶细胞（如肠道上皮细胞Caco-2、巨噬细胞RAW264.7），提取其mRNA并反转录为cDNA；

        构建宿主细胞cDNA文库（可直接购买商业化文库，如人/小鼠组织cDNA文库，节省时间）。

 

4、酵母双杂交筛选流程

（1）共转化与初筛

        将验证合格的BD-诱饵载体与猎物文库（AD-猎物）共转化至酵母细胞（如采用 PEG/LiAc 转化法），同时设置对照：

            阳性对照：BD-已知互作蛋白A+AD-已知互作蛋白B（确保系统有效）；

            阴性对照：BD-诱饵+AD-空载体（排除诱饵与AD的非特异性结合）。

        将转化后的酵母涂布于高严谨性筛选培养基（如SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade+X-α-Gal+AbA），30℃培养 3-5 天。

        筛选既能生长又能显色的克隆（报告基因His3、Ade2、MEL1均激活），标记为候选阳性克隆。

 

（2）复筛与去重复

        挑取候选克隆，转接至相同筛选培养基，验证生长和显色稳定性（排除瞬时激活的假阳性）。

        提取阳性克隆的AD质粒，通过 PCR 扩增插入的cDNA片段并测序，比对数据库（如NCBI、UniProt）确定猎物蛋白的编码基因，去除重复序列的克隆。

 

5、互作验证：排除假阳性

    酵母双杂交的假阳性率较高（如猎物蛋白自身激活、非特异性结合），需通过以下方法验证：

（1）回转验证
        将候选 AD-猎物质粒与BD-诱饵质粒重新共转化酵母，同时与BD-空载体共转化（排除猎物自激活），观察是否仍能激活报告基因。

 

（2）体外互作验证

        通过GST pull-down：表达 GST-诱饵融合蛋白和 His-猎物蛋白，检测 His-猎物是否能被 GST-诱饵吸附。

        通过免疫共沉淀（Co-IP）：在体外细胞体系（如 HEK293T）中过表达 Flag-诱饵和 Myc-猎物，用 Flag 抗体沉淀复合物，检测是否含 Myc-猎物。

 

（3）体内互作验证

        在细菌感染模型中验证：如构建荧光标记的诱饵蛋白（GFP-诱饵）和猎物蛋白（RFP-猎物），通过共聚焦显微镜观察两者在细菌内或宿主细胞中的共定位；

        功能验证：若猎物是宿主受体，敲除该受体后检测细菌黏附/入侵能力是否下降，证明互作的生物学意义。

 

三、实例：筛选细菌毒力因子与宿主受体的互作

    以肠出血性大肠杆菌（EHEC）的毒力因子Intimin（介导细菌与宿主肠上皮细胞的黏附）为例：

    选择intimin基因的胞外结构域作为诱饵，构建BD-Intimin载体（验证无自激活和毒性）；

    以人结肠上皮细胞Caco-2的cDNA文库作为猎物文库，共转化酵母后筛选；

    阳性克隆测序发现候选猎物为宿主细胞表面蛋白Tir（已知为 Intimin 的受体），通过Co-IP验证两者在感染过程中结合，最终证实该互作是EHEC定植的关键机制。

 

四、注意事项

    膜蛋白的特殊处理：若诱饵或猎物是膜蛋白（如细菌 Ⅲ 型分泌系统的膜结合蛋白），需使用膜定位酵母双杂交系统（如Split-Ubiquitin系统），避免核定位障碍。

    翻译后修饰差异：酵母与细菌/哺乳动物的翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）不同，可能漏筛依赖修饰的互作，需结合体外修饰系统验证。

    文库覆盖率：确保猎物文库覆盖目标蛋白（尤其是低丰度蛋白），可通过增加文库容量或分阶段筛选提高效率。

    通过以上流程，酵母双杂交技术可高效筛选与细菌毒力相关的蛋白质相互作用，为解析细菌致病的分子机制（如毒力调控、宿主入侵、免疫逃逸）提供关键候选互作对，后续结合功能实验可深入揭示其生物学意义。