外泌体提取的主要方法有哪些?分别有什么优缺点?
外泌体作为细胞分泌的纳米级囊泡,其提取方法的选择直接影响后续研究的准确性和可靠性。目前,外泌体提取的主要方法包括超速离心法、密度梯度离心法、沉淀法、色谱法、免疫亲和法、超滤法、微流控技术等。以下将从原理、操作步骤、优缺点等方面详细解析各方法的特性:
一、超速离心法(Ultracentrifugation)
1. 原理
利用不同大小和密度的颗粒在高速离心力下的沉降速率差异分离外泌体。通过逐步提高离心速度,依次去除细胞、细胞碎片、大囊泡,最终通过超高速离心沉淀外泌体。
2. 操作步骤
预离心:300×g 离心 10 分钟,去除细胞;
二次离心:2000×g 离心 20 分钟,去除细胞碎片;
高速离心:10,000×g 离心 30 分钟,去除大囊泡;
超速离心:100,000×g 离心 70 分钟,沉淀外泌体;
重悬:用 PBS 重悬沉淀,4℃保存。
3. 优缺点对比
优点
① 经典方法,纯度较高,被广泛认可;
② 无需特殊试剂,成本较低;
③ 可处理不同体积的样本。
缺点
① 耗时(全程需 4-6 小时),操作繁琐;
② 需专用超速离心机(设备昂贵);
③ 高速离心可能导致外泌体聚集或破损;
④ 低丰度样本易损失。
4. 适用场景
实验室常规提取,尤其适用于细胞培养上清液的外泌体分离,对纯度要求较高的基础研究。
二、密度梯度离心法(Density Gradient Centrifugation)
1. 原理
在超速离心基础上,利用蔗糖、碘克沙醇(OptiPrep)或氯化铯等形成密度梯度,使不同密度的颗粒(如外泌体、蛋白质、其他囊泡)分布于特定梯度层,从而实现精确分离。
2. 操作步骤
制备梯度:将蔗糖溶液(5%-60%)或碘克沙醇(10%-60%)按密度梯度分层加入离心管;
加样离心:将预离心的样本置于梯度顶部,100,000×g 离心 16-20 小时;
收集分层:外泌体通常位于密度 1.13-1.19 g/mL 的梯度层,用吸管分段收集;
洗涤浓缩:对目标层进行超速离心(100,000×g,70 分钟),重悬后使用。
3. 优缺点对比
优点
① 纯度极高,可分离特定密度的外泌体;
② 能有效去除蛋白质和其他囊泡污染;
③ 分离的外泌体形态和功能保存较好。
缺点
① 操作复杂,耗时长达 1 天;
② 需专用梯度材料(如碘克沙醇成本高);
③ 样本处理量小,可能损失部分外泌体;
④ 梯度制备需严格控制密度分层。
4. 适用场景
需要高纯度外泌体的功能研究(如细胞间通讯机制)、外泌体标志物鉴定或临床样本分析。
三、沉淀法(Precipitation)
1. 原理
利用聚乙二醇(PEG)、鱼精蛋白或抗体等试剂与外泌体表面蛋白结合,通过降低溶剂溶解度使外泌体沉淀。以 PEG 沉淀法为例,其通过脱水作用破坏外泌体周围的水化层,促使囊泡聚集沉淀。
2. 操作步骤(PEG-8000 法)
预离心:300×g 离心 10 分钟,去除细胞;
加 PEG 溶液:向样本中加入 1/4 体积的 PEG-8000(终浓度 8%-15%),4℃静置过夜;
低速离心:10,000×g 离心 30 分钟,收集沉淀;
重悬洗涤:用 PBS 重悬,10,000×g 离心 20 分钟,去除 PEG 残留。
3. 优缺点对比
优点
① 操作简单,无需特殊设备(普通离心机即可);
② 耗时短(24 小时内完成),适合高通量样本;
③ 成本低,试剂易得;
④ 可处理血清、尿液等复杂生物流体。
缺点
① 纯度低,易混入蛋白质聚集体、脂蛋白等杂质;
② PEG 可能影响外泌体功能(如膜蛋白活性);
③ 沉淀效率受样本成分影响(如血清中脂蛋白干扰);
④ 难以分离小粒径外泌体(<100 nm)。
4. 适用场景
临床样本(如血液、尿液)的快速预处理、外泌体粗提取,或对纯度要求不高的初步研究(如 RNA 检测)。
四、尺寸排阻色谱法(Size-Exclusion Chromatography, SEC)
1. 原理
利用色谱柱中多孔凝胶的分子筛效应,按分子大小分离外泌体。小颗粒(如蛋白质)进入凝胶孔道,迁移速度慢;外泌体等大颗粒直接流过柱床,最先被洗脱。
2. 操作步骤
平衡柱子:用 PBS 平衡 SEC 柱(如 Sepharose 4B 或 Sephacryl S-100);
上样洗脱:将预离心的样本注入柱中,用 PBS 匀速洗脱;
收集 fractions:按洗脱顺序收集液体,外泌体通常在第 3-5 个管段(根据柱效调整);
浓缩:对目标管段进行超滤浓缩(100 kDa 膜),去除缓冲液。
3. 优缺点对比
优点
① 纯度高,可有效分离外泌体与蛋白质;
② 保持外泌体天然形态和功能;
③ 非选择性分离,适合全外泌体群体分析;
④ 操作相对简便,可自动化。
缺点
① 处理量小(单次通常≤5 mL 样本);
② 洗脱时间长(1-2 小时),需专用色谱设备;
③ 柱材成本较高,重复使用需严格清洗;
④ 样本中大颗粒(如细胞碎片)易堵塞柱子。
4. 适用场景
外泌体形态学分析(如电镜观察)、功能研究(如细胞摄取实验)、需要保留外泌体完整性的机制研究。
五、免疫亲和法(Immunoadhesion)
1. 原理
利用抗体(如抗 CD63、CD9、CD81 等外泌体标志物抗体)与外泌体表面蛋白特异性结合,通过磁珠、琼脂糖珠或板载抗体捕获外泌体,实现靶向分离。
2. 操作步骤(磁珠法)
抗体偶联磁珠:将抗 CD63 抗体与磁珠(如 Protein A/G 磁珠)孵育;
样本孵育:将磁珠 - 抗体复合物与预离心样本在 4℃孵育 2 小时;
磁分离:置于磁力架上,弃上清,用 PBS 洗涤磁珠 3 次;
洗脱外泌体:用低 pH 缓冲液或竞争肽洗脱外泌体,中和后使用。
3. 优缺点对比
优点
① 特异性极高,可分离含特定标志物的外泌体亚群;
② 纯度高,几乎无其他囊泡污染;
③ 操作相对简便,耗时约 3 小时;
④ 适合研究特定细胞来源的外泌体(如肿瘤细胞外泌体)。
缺点
① 成本高(抗体和磁珠昂贵);
② 仅能分离表达特定标志物的外泌体,可能遗漏其他亚群;
③ 抗体结合可能影响外泌体功能;
④ 样本量受限(通常≤1 mL),不适合大规模提取。
4. 适用场景
外泌体亚群特异性研究(如肿瘤标志物筛选)、外泌体靶向药物递送载体的制备。
六、超滤法(Ultrafiltration)
1. 原理
利用不同孔径的超滤膜(通常 100 kDa 或 300 kDa),通过离心或压力驱动,使小于膜孔的分子(如水、蛋白质)透过膜,而外泌体(直径 30-150 nm)被截留,实现分离浓缩。
2. 操作步骤(离心超滤法)
预离心:300×g 离心 10 分钟,去除细胞;
超滤管处理:将样本加入 100 kDa 超滤管(如 Amicon Ultra),4000×g 离心 30 分钟;
反洗回收:向超滤膜上加入 PBS,反向离心(1000×g,5 分钟)回收外泌体;
重复洗涤:可重复超滤 2-3 次,去除小分子杂质。
3. 优缺点对比
优点
① 操作简单,耗时短(30 分钟 - 1 小时);
② 设备成本低(仅需超滤管和普通离心机);
③ 可同时实现分离和浓缩;
④ 适合小体积样本(如 1-5 mL)的快速处理。
缺点
① 纯度低,易混入大颗粒杂质(如凋亡小体);
② 超滤压力可能导致外泌体变形或破裂;
③ 膜孔易被蛋白质堵塞,影响回收率;
④ 无法分离不同大小的外泌体亚群。
4. 适用场景
外泌体 RNA / 蛋白质的初步提取、样本浓缩(如后续需结合其他方法纯化),或高通量筛选前的快速预处理。
七、微流控技术(Microfluidics)
1. 原理
利用微通道内的流体力学、介电泳或免疫亲和作用,在微米级芯片上实现外泌体的高效分离。例如,通过介电泳力(DEP)根据颗粒的电学性质差异分离外泌体与杂质。
2. 操作步骤(介电泳法)
芯片预处理:在微流控芯片通道内施加交变电场;
样本注入:将预离心的样本通过微量泵注入芯片;
分离收集:外泌体在介电泳力作用下偏离主流道,被特定端口收集;
纯化浓缩:收集液经低速离心去除气泡,超滤浓缩后使用。
3. 优缺点对比
优点
① 高通量、高速度(分钟级处理);
② 所需样本量极少(μL 级),适合珍贵样本;
③ 可精确控制分离条件,分离效率高;
④ 可集成多种功能(如分离 + 检测)。
缺点
① 设备和芯片成本极高,需专业技术操作;
② 芯片制备复杂,难以普及;
③ 大规模生产或大量样本处理受限;
④ 后续放大应用存在技术挑战。
4. 适用场景
临床微量样本(如脑脊液、穿刺液)的外泌体分析、外泌体实时检测或个性化医疗研究。
八、其他新兴方法
1. 聚合物沉淀法改良(如 ExoQuick)
原理:优化 PEG 配方(如添加电解质),提高沉淀效率和纯度。
优点:比传统 PEG 法纯度略高,操作更简便;
缺点:仍存在蛋白质污染,成本稍高。
2. 亲和层析法(Affinity Chromatography)
原理:利用外泌体表面糖基化修饰与凝集素(如 ConA)的特异性结合分离外泌体。
优点:非抗体依赖,成本较低;
缺点:特异性低于免疫亲和法,适用范围有限。
3. 双水相萃取法(Aqueous Two-Phase Extraction)
原理:利用聚合物 - 盐或聚合物 - 聚合物形成的双水相体系,根据疏水性差异分离外泌体。
优点:温和、高效,适合工业规模生产;
缺点:体系优化复杂,纯度有待提高。
九、不同提取方法的综合对比与选择策略
1. 方法对比表格
方法 |
纯度 | 产量 | 耗时 | 设备成本 | 适用场景 |
超速离心法 |
★★★★ | ★★★ | 4-6h | 高 | 实验室常规纯化,基础研究 |
密度梯度离心法 |
★★★★★ | ★★ | 16-20h | 极高 | 高纯度功能研究,标志物鉴定 |
PEG 沉淀法 |
★★ | ★★★★ | 1-24h | 低 | 临床样本快速处理,粗提取 |
SEC 色谱法 |
★★★★ | ★★★ | 1-2h | 中 | 形态学分析,功能保留研究 |
免疫亲和法 |
★★★★★ | ★★ | 3h | 极高 | 亚群特异性研究,靶向载体制备 |
超滤法 |
★★ | ★★★ | 0.5-1h | 低 | 样本浓缩,初步提取 |
微流控技术 |
★★★★ | ★★★ | 分钟级 | 极高 | 微量样本分析,实时检测 |
2. 选择策略
若追求高纯度:优先选择密度梯度离心法或SEC 色谱法,结合免疫亲和法可进一步提高亚群特异性。
若注重操作简便:选择PEG 沉淀法或超滤法,适合高通量或临床样本的快速处理。
若样本量少或珍贵:选择微流控技术或免疫亲和法,减少样本损失。
若需工业生产:考虑超滤法(结合 SEC)或双水相萃取法,兼顾效率和成本。
十、总结与注意事项
外泌体提取方法的选择需综合考虑研究目的、样本类型、设备条件和成本。例如,基础机制研究需高纯度外泌体,可采用 “超速离心 + 密度梯度离心” 联用;临床诊断或大规模筛选则更依赖 “PEG 沉淀 + SEC” 的快速组合方案。此外,无论采用何种方法,均需通过电镜、NTA、WB 等技术对提取的外泌体进行鉴定(如前所述的金标准方法),以确保结果的可靠性。未来,随着微流控、纳米材料等技术的发展,外泌体提取将向自动化、高特异性和规模化方向进一步突破。
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